雁北嗜藍(lán)孢孔菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)谷物總酚含量及抗氧化性能的影響

關(guān)鍵詞：雁北嗜藍(lán)孢孔菌； 固態(tài)發(fā)酵； 谷物； 總酚； 抗氧化性

中圖分類號(hào)：TS210.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2023）03-0112-07

嗜藍(lán)孢孔菌屬（Fomitiporia）真菌是一類非常重要的藥用真菌，多糖、脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)豐富，還含有三萜、維生素、黃酮、甾醇等多種活性成分，對(duì)人類健康保健品的開發(fā)，具有很重要的價(jià)值［1］。本研究使用的菌株為雁北嗜藍(lán)孢孔菌（Fomitiporia yanbeiensis）［2］，用該菌菌核泡水喝，可治療發(fā)熱、哮喘、糖尿病、降血糖，抗腫瘤、抗菌以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力［3］。有報(bào)道稱，該真菌富含孕烯醇酮型三萜，對(duì)治療癌癥具有積極作用［4］。在之前的研究中，課題組對(duì)雁北嗜藍(lán)孢孔菌子實(shí)體的化學(xué)成分和營養(yǎng)成分進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，該真菌是天然存在的多糖和多酚等潛在抗氧化劑的重要來源［5-6］。

固態(tài)發(fā)酵是指微生物在沒有或幾乎不含自由水的培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行生長(zhǎng)的過程［7］。我國早期固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品有醬油，醋，豆渣等［8-9］。有報(bào)道稱微生物的固態(tài)發(fā)酵不僅可以提高基質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，還能改善口感［10-12］。翟飛紅等［13］采用姬松茸和雙孢蘑菇對(duì)小米進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期完成以后，小米的蛋白質(zhì)質(zhì)量和多酚含量均有不同程度的提高。因此，采用大型真菌固態(tài)發(fā)酵谷物是改善谷物營養(yǎng)成分，提高谷物附加值的有效途徑。

雁北嗜藍(lán)孢孔菌在自然界中生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，加上近年人為濫采亂挖，資源匱乏，對(duì)其菌絲體的開發(fā)研究是一種有效的替代方式，因此，本文以5 種不同的谷物作為發(fā)酵基質(zhì)，通過雁北嗜藍(lán)孢孔菌固態(tài)發(fā)酵后，對(duì)發(fā)酵終產(chǎn)物的總多酚含量及其總抗氧化活性進(jìn)行分析。山西靜樂縣素有“ 中國藜麥之鄉(xiāng)”的美稱，提高藜麥附加值，對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大藜麥種植業(yè)具有重要意義。因此，本研究對(duì)發(fā)酵藜麥的抗氧化性進(jìn)行分析，旨在為雁北嗜藍(lán)孢孔菌的菌絲體研究，谷物營養(yǎng)和新型食品原料的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 供試菌株

雁北嗜藍(lán)孢孔菌（Fomitiporia yanbeiensis G1）保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，文中雁北嗜藍(lán)孢孔菌用G1 表示。

1. 2 培養(yǎng)基制備

試驗(yàn)所用谷物（大米、黃米、藜麥、玉米和黑米）由山西功能食品研究院提供。

配方：谷物（浸泡6 h）200 g、葡萄糖（1. 6 g）、酵母膏（0. 4 g）、KH₂PO₄（1. 0 g）、MgSO₄·7H₂O（0. 5 g）、Fecl₃（0. 05 g）、Cacl₂·2H₂O（0. 1 g），含水量65%，初始pH 值6. 5［7］。

1. 3 固態(tài)發(fā)酵

發(fā)酵基質(zhì)121 ℃高壓滅菌30 min，挑取帶PDA 培養(yǎng)基的F. G1 菌塊（直徑8 mm）5 塊，在超凈工作臺(tái)中，室溫下接種，25 ℃避光培養(yǎng)35 d 取樣，樣品在60 ℃條件下過夜干燥，研磨并過0. 4 mm 篩，備用［7］。

1. 4 液態(tài)發(fā)酵在PDA 平板上選取5 塊菌塊（直徑5 mm）接種至含有100 mL 液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1. 5 g，KH2PO41. 5 g，自來水1000 mL，自然pH）的三角瓶（容量250 mL）中，25 ℃，135 r·min-1，避光培養(yǎng)7 d，然后以30% 的接種量接種至無菌的液體培養(yǎng)基（150 mL）中，25 ℃，135 r·min-1，避光培養(yǎng)15 d，取樣，置于4 ℃ 保存，備用［7］。

1. 5 谷物提取物

提取物制備方法參照文獻(xiàn)［6-7］。

1. 6 總酚含量的測(cè)定

總酚含量采用Folin-Cioncalteu 比色法測(cè)定［7］。

1. 7 抗氧化活性分析

1. 7. 1 DPPH 自由基清除活性測(cè)定參照課題組前期所用方法［7-8］，稱取1. 3 中所得粉末100 μg 放入10 mL 試管中，加入4 mLDPPH（體積分?jǐn)?shù)0. 004%）溶液（甲醇為溶劑）混合，劇烈搖動(dòng)，搖勻后避光反應(yīng)30 min，5000 r·min^-1 離心10 min，取上清，然后采用紫外-可見分光光度計(jì)在517 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，按照式（1）對(duì)DPPH 自由基清除率進(jìn)行計(jì)算：

式中：A₁為樣品吸光度；A₂為不加超氧陰離子自由基的樣品吸光度；A₀為空白對(duì)照組吸光度。

1. 7. 4 鐵離子螯合能力測(cè)定

鐵離子螯合能力測(cè)定參照文獻(xiàn)［6-7］，反應(yīng)終止以后于550 nm 處測(cè)定吸光度。按照式（3）對(duì)螯合能力進(jìn)行計(jì)算：

式中：A₁為樣品吸光度；A₀為空白對(duì)照組吸光度。

1. 7. 5 總抗氧化活性測(cè)定

總抗氧化活性采用T-AOC 試劑盒測(cè)定，試劑盒購自山西修通生物科技有限公司。

1. 8 提取條件對(duì)發(fā)酵藜麥總抗氧化性的影響

取上述試驗(yàn)所得發(fā)酵藜麥粉，選取料液比1∶20，80% 乙醇提取，pH 7. 0，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間60 min 為固定條件，分別考察提取溶劑（正己烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇）、溶劑濃度（60、式中：A₁為樣品吸光度；A₀為空白對(duì)照組吸光度。70、80、90、100） mg·g^-1、提取溫度（20、30、40、50、60、70、80） ℃ 、提取時(shí)間（20、40、60、80、100） min這4 個(gè)因素對(duì)提取物總抗氧化性的影響。

1. 9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16. 0 進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 發(fā)酵谷物總酚含量及抗氧化活性

F. G1 在所選5 種基質(zhì)上都生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速率由大到小依次為：藜麥gt; 黑米gt; 玉米gt; 大米gt;黃米。從圖1 可以看出，經(jīng)F. G1 固態(tài)發(fā)酵以后，除黑米外，發(fā)酵谷物中總酚含量均顯著高于對(duì)照，黃米的熱水提取物總酚含量高于乙醇提取，最高值可達(dá)8. 37 mg·g^-1，其次是發(fā)酵藜麥的水提取物（8. 13 mg·g^-1），分別是對(duì)照組水提取物總酚含量（1. 98 和1. 87 mg·g^-1）的4. 23 和4. 35 倍。

由圖2 可見，發(fā)酵黑米的乙醇提取物抗氧化活性最高，為473. 41 U·g^-1，其次為藜麥醇提取物（470. 32 U·g^-1），稍低于Vc（501. 32 U·g^-1）。而發(fā)酵大米、黃米和玉米的乙醇提取物總抗氧化活性均在300 U·g^-1 以下（圖2a）。由圖2b 可知，所有發(fā)酵谷物水提物的總抗氧化活性均低于Vc（453. 32 U·g^-1）。

2. 2 發(fā)酵方式對(duì)藜麥抗氧化活性的影響

藜麥接種F. G1 后，總酚含量與總抗氧化性都有所提高，故后續(xù)試驗(yàn)以藜麥為基質(zhì)，進(jìn)行F. G1菌絲體發(fā)酵研究。為了進(jìn)一步探究真菌發(fā)酵對(duì)基質(zhì)的影響，對(duì)F. G1 固態(tài)發(fā)酵（SSF）與液態(tài)發(fā)酵（LSF）產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行了對(duì)比分析。由圖3 可以看出，無論是固態(tài)發(fā)酵還是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物均表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，而且不同提取濃度對(duì)DPPH 自由基的清除能力存在顯著差異，依次為：4 mg·mL^-1（SSF）gt;4 mg·mL^-1（LSF）gt;2 mg·mL^-1（SSF）gt;2 mg·mL^-1 （LSF）。除此之外，SSF 4 mg·mL^-1提取物對(duì)羥基自由基的還原能力最高（51. 28%），LSF 4 mg·mL^-1 提取物對(duì)羥基自由基的還原能力次之（48. 62%）。超氧陰離子自由基清除能力和亞鐵離子螯合能力測(cè)定結(jié)果與DPPH 和羥基自由基還原反應(yīng)結(jié)果相當(dāng)。

2. 3 提取條件對(duì)發(fā)酵藜麥總抗氧化活性的影響

2. 3. 1 溶劑對(duì)發(fā)酵藜麥抗氧化性能的影響

選取溶劑（正己烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和乙醇）對(duì)發(fā)酵終產(chǎn)物進(jìn)行提取，并對(duì)其進(jìn)行總抗氧化性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，乙醇提取物的抗氧化活性最高（448. 32 U·g^-1），其次是乙酸乙酯提取物（384. 32 U·g^-1）、氯仿提取物（382. 16 U·g^-1）和丙酮提取物（379. 21 U·g^-1），正己烷提取物的抗氧化活性最低，為283. 12 U·g^-1。

2. 3. 2 乙醇濃度對(duì)發(fā)酵藜麥抗氧化性能的影響

由圖4b 可見，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到100%，即無水乙醇，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性顯著提高（682. 46 U·g^-1） ，比對(duì)照（532. 65 U·g^-1） 提高34. 65%。

2. 3. 3 提取溫度對(duì)發(fā)酵藜麥抗氧化活性的影響

選取2. 3. 1 和2. 3. 2 篩選出的最佳提取試劑及濃度（提取試劑為乙醇，濃度為100%）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，由圖4c 可知，在20～50 ℃，隨著溫度升高，提取物的抗氧化活性不斷升高，當(dāng)溫度高于50 ℃，隨著溫度升高，提取物的抗氧化活性開始降低。

2. 3. 4 提取時(shí)間對(duì)發(fā)酵藜麥抗氧化活性的影響

選取2. 3. 1、2. 3. 2 和2. 3. 3 篩選出的最佳提取試劑及濃度（提取試劑為乙醇，濃度為100%，提取溫度50 ℃）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，由圖4d 可知，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性隨提取時(shí)間的變化而變化。在提取時(shí)間為20～80 min 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高；當(dāng)提取時(shí)間為80 min 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性達(dá)到最大值（691. 26 U·g^-1）。當(dāng)提取時(shí)間超過80 min 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性開始降低。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化后的條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性為869. 72 U·g^-1，是未優(yōu)化前（470. 32 U·g^-1）的1. 85 倍。

3 討論

五谷雜糧富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等多種營養(yǎng)成分，能降低膽固醇、預(yù)防心血管等疾病，是人體膳食纖維的主要來源［7］。本研究結(jié)果表明，經(jīng)雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 固態(tài)發(fā)酵以后，5 種谷物總酚含量和總抗氧化性存在顯著差異，黃米水提物中總酚含量達(dá)到最大值（8. 37 mg·g^-1），是未發(fā)酵黃米水提物（1. 98 mg·g^-1）的4. 23 倍；而黑米的乙醇提取物總抗氧化活性最高可達(dá)到773. 41 U·g^-1，是對(duì)照組（220. 64 U·g^-1）的3. 51 倍。由此看來，雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 以谷物為基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量和抗氧化性變化規(guī)律與谷物本身的生物學(xué)特性有關(guān)［14-15］。除此之外，提取方法也會(huì)對(duì)總酚含量和抗氧化性產(chǎn)生影響［7-8］。

本研究的試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，以藜麥作為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量和抗氧化性均高于未發(fā)酵組，山西是藜麥之鄉(xiāng)，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)利用很有必要，因此選用單因素試驗(yàn)考察了不同提取工藝參數(shù)對(duì)發(fā)酵藜麥總抗氧化性的影響，結(jié)果表明，采用無水乙醇于50 ℃ 水浴振蕩提取80 min，發(fā)酵藜麥總抗氧化性可達(dá)848. 13 U·g^-1，是未發(fā)酵藜麥（148. 32 U·g^-1）的5. 72 倍。以DPPH、OH^-、O^2-、Fe²⁺為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察了藜麥在不同發(fā)酵方式不同濃度下的抗氧化性，結(jié)果表明，無論是固態(tài)發(fā)酵還是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物均表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，而且濃度越大，抗氧化活性越高。由此看來，采用大型真菌對(duì)谷物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，可有效改善谷物的抗氧化性［16-19］。這可能是因?yàn)檎婢诠任锱囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生不同類型的胞外酶，以此來修飾基質(zhì)的生物活性物，從而改變生物活性［3，20-21］。

綜上所述，雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 固態(tài)發(fā)酵后的谷物提取物比未發(fā)酵的谷物具有更高的抗氧化活性，該研究結(jié)果可為進(jìn)一步開發(fā)利用雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 的菌絲體提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

1）經(jīng)雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 固態(tài)發(fā)酵以后，發(fā)酵谷物中總酚含量和抗氧化性均顯著高于對(duì)照（黑米除外）；

2）無論是固態(tài)發(fā)酵還是液態(tài)發(fā)酵，雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 發(fā)酵藜麥均表現(xiàn)出較高的抗氧化活性；而且濃度越大，抗氧化性越高；

3）發(fā)酵藜麥的抗氧化活性隨提取條件的變化而變化。采用無水乙醇于50 ℃ 水浴振蕩提取80 min，發(fā)酵藜麥總抗氧化性可達(dá)848. 13 U·g^-1，是未發(fā)酵藜麥（148. 32 U·g^-1）的5. 72 倍。說明采用雁北嗜藍(lán)孢孔菌G1 作為出發(fā)菌株，對(duì)藜麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，可有效提高藜麥的營養(yǎng)價(jià)值和生物活性。