微生物菌肥對鹽堿地向日葵減施氮肥效應(yīng)研究

關(guān)鍵詞：鹽堿地； 微生物菌肥； 減施氮肥； 向日葵產(chǎn)量

中圖分類號：S144.9 文獻標識碼：A 文章編號：1671-8151（2023）03-0102-10

內(nèi)蒙古河套灌區(qū)是黃河上游典型的鹽漬化區(qū)域，其土壤母質(zhì)含鹽量高、干旱少雨、灌排不暢以及地下水位高是導(dǎo)致該地區(qū)鹽堿化的主要原因［1-2］。灌區(qū)鹽堿地面積大、分布廣，且土壤肥力差，嚴重制約了灌區(qū)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。自上世紀60 年代以來，國內(nèi)外學者圍繞河套灌區(qū)的鹽漬化防治及環(huán)境效應(yīng)等方面開展了大量的科學研究，并提出了平衡施肥、合理輪作、工程灌排、物理和化學改良劑等多種改良措施［3］，取得了一定的成效，但同時也存在許多“頑疾”，未能形成經(jīng)濟效益與生態(tài)效益雙贏的發(fā)展模式，亟需尋找一種新的改良措施。生物措施作為近年來快速發(fā)展的改良方式，具有見效快且持續(xù)性強、無二次污染和可大面積應(yīng)用等優(yōu)點，是最具潛力的土壤改良措施之一［4］。

微生物改良是生物改良措施的典型代表，微生物菌肥中的有益微生物可通過自身代謝產(chǎn)物來改善土壤結(jié)構(gòu)、促進礦物質(zhì)吸收，強化溶磷固氮，為作物營造良好的生存環(huán)境，提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)，降低作物對化肥的依賴性［5-6］。目前微生物菌肥已在改良土壤養(yǎng)分、提高作物產(chǎn)量、防病、防蟲和促生等方面取得良好的應(yīng)用效果［7-9］，例如，滿全莉［10］通過添加有效微生物菌劑和從鹽堿地中分離耐鹽堿菌株并施加到鹽堿地的方式探究微生物對鹽堿地改良的效果和機制；沙月霞等［11］研發(fā)用于寧夏鹽堿地玉米莖基腐病預(yù)防和生長的微生物菌劑，對鹽堿地玉米病害防治具有重要意義。侯樂梅等［12］研究添加不同微生物菌劑對基質(zhì)酶活性和番茄產(chǎn)量及品質(zhì)的影響，以期為無土栽培基質(zhì)優(yōu)化研究提供參考和依據(jù)。但河套灌區(qū)關(guān)于微生物菌肥對作物生長及減施氮肥效應(yīng)的研究較少。本研究開展微生物菌肥對作物生長及減施氮肥效應(yīng)田間的試驗，旨在為河套灌區(qū)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展提供科學支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗地位于河套灌區(qū)巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學研究所科技園區(qū)（107°16 ′43 ″E，40°47 ′42 ″N）。年均氣溫3. 7～7. 6 ℃ ，有效積溫2 776. 7～3 683. 9 ℃ ，日照時數(shù)3100～3300 h，無霜期129～142 d，年降水量150～200 mm，年蒸發(fā)量2032～3179 mm，為典型中溫帶大陸性季風氣候。試驗地排灌方便，地力均勻，屬于輕中度鹽堿土，全鹽含量2～6 g·kg^-1，pH 值介于8. 5～9. 5，養(yǎng)分含量中等。

1. 2 供試材料

向日葵品種：選用當?shù)刂髟允秤孟蛉湛贩NSH363；ETS 微生物菌肥主要由托馬斯菌群和巴斯德菌群組成，其中好氧菌占40%，厭氧菌占60%；化肥使用當?shù)爻Ｒ?guī)品種，尿素、磷酸二銨等。

1. 3 試驗設(shè)置

試驗采取裂區(qū)試驗設(shè)計，共設(shè)置11 個處理，其中

T0：氮肥空白處理（PK）；TCK：常規(guī)施肥不施微生物菌肥為對照（NPK）；

T1：施加菌肥3000 kg·hm^-2+ 氮肥減量15%（ETS1+N?15%）；

T2：施加菌肥3000 kg·hm^-2+ 氮肥減量30%（ETS1+N?30%）；T3：施加菌肥3000 kg·hm^-2+ 氮肥減量45%（ETS1+N?45%）；

T4：施加菌肥6000 kg·hm^-2+ 氮肥減量15%（ETS2+N?15%）；

T5：施加菌肥6000 kg·hm^-2+ 氮肥減量30%（ETS2+N?30%）；

T6：施加菌肥6000 kg·hm-2+ 氮肥減量45%（ETS2+N?45%）；

T7：施加菌肥9000 kg·hm^-2+ 氮肥減量15%（ETS3+N?15%）；

T8：施加菌肥9000 kg·hm^-2+ 氮肥減量30%（ETS3+N?30%）；

T9：施加菌肥9000 kg·hm^-2+ 氮肥減量45%（ETS3+N?45%）。

具體處理及肥料、微生物用量見表1。

每個處理3 次重復(fù)。本試驗共設(shè)置33 個小區(qū)，小區(qū)之間間隔1 m，走道2 m。向日葵大小行種植，其中：大行100 cm、小行40 cm，株距60 cm。微生物菌肥結(jié)合整地均勻翻入土壤耕層。

1. 4 樣品采集及測定

作物產(chǎn)量：收獲期在各小區(qū)中間2 膜進行測產(chǎn)。記錄收獲株數(shù)，籽粒自然晾干稱重，折算出向日葵產(chǎn)量。

作物生育性狀：向日葵每小區(qū)標記10 株，在生長關(guān)鍵時期測定標記株的株高、莖粗、葉綠素、盤徑指標。

根據(jù)試驗設(shè)計，采用五點取樣法分別采集向日葵收獲后各小區(qū)0～20 cm、20～40 cm 土壤樣品并混合均勻，土樣分為3 部分，一部分置于陰涼處自然風干，風干后過2. 0 mm 塑料篩備用；一部分置于?20 ℃冰箱冷凍保存，另一部分保存?80 ℃冰箱進行微生物的測定。

土壤含水率（SWC）采用烘干法測定；土壤孔隙度（SP）采用環(huán)刀法測定；全鹽含量（SSC）土壤鹽度用DDS-307 電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，并按照相關(guān)公式加以計算［13］；堿化度（SA）根據(jù)測定的土壤水溶性鉀、鈣、鈉、鎂等離子并加以計算得到［14］；pH采用pH 計測定（水土比為2. 5∶1）；土壤有機質(zhì)（OM）采用碳氮元素分析儀（Euro Vector EA3000型）測定。

土壤微生物利用16SrRNA 擴增子測序技術(shù)進行測序分析：使用土壤微生物DNA 提取試劑盒（DNeasy PowerSoil Kit）提取土壤DNA，之后用超微量分光光度計（NanoDrop）測量DNA 濃度和純度用于后續(xù)分析。使用通用引物515F 和806R 對細菌16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)進行擴增。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行建庫，并在NovaSeq6000 平臺進行測序。

1. 5 統(tǒng)計分析

處理間的土壤理化性質(zhì)利用SPSS22 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 多重比較檢驗法分析處理間的差異，顯著性水平設(shè)置為0. 05，用Origin 9. 0 進行繪圖；土壤微生物測序數(shù)據(jù)由Fastp 軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，F(xiàn)lash軟件進行拼接，根據(jù)97% 的相似度對序列進行OTUs 聚類，并進行物種分類注釋，得到對應(yīng)的物種信息和相對豐度分布情況。計算微生物群落物種的豐富度和多樣性指數(shù)，包括物種數(shù)目（Observedspecies）、Chao1 指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)（Shannon）。之后，基于16srRNA 測序結(jié)果，計算各OTU 相對豐度與作物產(chǎn)量等表型及土壤理化性質(zhì)間的皮爾森相關(guān)性系數(shù)，并根據(jù)對應(yīng)的p 值篩選出與作物產(chǎn)量顯著相關(guān)的OTU。

2 結(jié)果與分析

2. 1 向日葵產(chǎn)量及農(nóng)藝性狀

從向日葵產(chǎn)量結(jié)果來看（表2），微生物菌肥施用量相同的處理中（3000、6000、9000 kg·hm^-2），向日葵產(chǎn)量均隨著氮肥減量的增加而減少；其中，氮肥減量15% 和30% 時，向日葵產(chǎn)量變化幅度較小，但仍高于對照組。3 種微生物菌肥施用量的處理中，氮肥減量45% 處理的向日葵產(chǎn)量均受到顯著抑制，低于對照組。這表明，在施用微生物菌肥的情況下，可適當削減氮肥的使用量，但氮肥減量不宜超過30%。

從成熟期向日葵的農(nóng)藝性狀來看（表2），不同的施肥處理會對株高、徑粗、葉綠素含量以及盤徑大小產(chǎn)生顯著的影響（Plt;0. 05）。其中T1～T9 處理的株高（167. 17±2. 93）～（213. 00±2. 00） cm顯著高于T0 和TCK 處理（154. 33±5. 35）～（169. 33±1. 61） cm；徑粗的最大值為T8 處理（29. 90±0. 98） mm、葉綠素含量最高為T9 處理（45. 79±2. 85） mg·g^-1、盤徑的最大值為T7 處理（24. 33±1. 80） cm。株高、徑粗、葉素含量及盤徑最大值均出現(xiàn)在施用微生物菌肥的處理組別中，這表明微生物菌肥配施化肥減氮在一定程度上能促進向日葵植株的生長。

2. 2 土壤理化指標

由圖1A 可知，各處理0～20 cm 土層土壤含水率在（10. 86%±0. 86%）～（13. 66%±0. 40%）。氮肥減量15%、30% 的處理中，土壤含水率均隨著微生物菌肥用量增加顯著增加。由圖1B 可知，各處理0～20 cm 土層土壤孔隙度在（34. 69±0. 07）～（41. 99±0. 87） g·cm^-3，氮肥減量15% 和30% 的處理中，土壤孔隙度隨著菌肥用量增加而增加；氮肥減量45% 的處理中，孔隙度隨著菌肥用量增加而減小。

由圖2 可知，不同施肥處理對土壤堿化度存在顯著影響。與對照組相比，施用微生物菌肥組別的0～20 cm、20～40 cm 土層土壤堿化度均有顯著降低，分別為0. 18%～5. 5% 和1. 47%～5. 97%；0～20 cm 土層的土壤堿化度隨著微生物菌肥用量的增加而顯著降低。

由圖3 可知，不同施肥處理對土壤全鹽量存在顯著影響。與對照相比，T4、T5 及T7 處理0～20 、20～40 cm 土層土壤中全鹽量均顯著降低。

由圖4 可知，不同施肥處理對土壤pH 均無顯著影響。0～20 cm、20～40 cm 土層土壤中pH 在（8. 67±0. 06）～（8. 83±0. 06）范圍內(nèi)波動。

由圖5 可知，0～20 cm 層土壤有機質(zhì)含量在（7. 77±0. 04）～（13. 08±0. 13）g·kg^-1 范圍內(nèi)顯著高于20～40 cm 土層土壤有機質(zhì)含量。0～20 cm土層，施用微生物菌肥各處理有機質(zhì)含量均顯著高于對照，這表明微生物菌肥配施化肥減氮可顯著提高鹽堿地土壤有機質(zhì)含量。

2. 3 土壤微生物群落構(gòu)與多樣性

對接種微生物菌劑ETS 后不同減氮處理下土壤微生物細菌群落進行了16SrRNA 測序。首先對不同處理下土壤微生物群落OTU 組成差別進行分析，結(jié)果如圖6 所示。11 個樣本所共有的微生物OTU 數(shù)量為1447，各樣本獨有的OTU 數(shù)量則各有差異?？傮w上看，獨有OTU 數(shù)隨著減氮水平的增加呈現(xiàn)出上升趨勢，隨著菌劑添加量的增加也呈現(xiàn)出上升趨勢：低、中、高3 個減氮水平下，平均每個樣本中的獨有OTU 數(shù)量依次為160. 67，187. 33 與193. 33；低、中、高3 個菌劑添加水平下，平均每個樣本中的獨有OTU 數(shù)量依次為162，188. 67 與190. 67。在低減氮水平及低菌劑添加水平下，樣本獨有OTU 數(shù)量小于對照組TCK（172個獨有物種），而隨著減氮水平的增加與菌劑添加量的增加，樣本獨有OTU 數(shù)量逐漸超過對照組TCK。上述結(jié)果表明菌劑的添加可能會增加微生物群落中的稀有OTU。

其次，通過組成分析進一步明晰微生物群落結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果如圖7 所示，與對照組（TCK）相比，各處理組的微生物分布并無明顯差異。其中在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度較高。與對照組相比，放線菌門（Actinobacteriota）和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的相對豐度有明顯下降（分別減少了60. 37% 和63. 32%），而擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度則有明顯上升（分別增加了266. 12% 和104. 67%），有研究表明，擬桿菌門在發(fā)病率低及抑病型土壤中相對豐度較高，該菌門也被證明可以促進植物生長且有抑制病原菌致病性的作用［15］。這些結(jié)果表明，菌劑的添加對微生物群落組成分布有一定的影響。

最后對不同處理下微生物群落的Alpha 多樣性進行了分析。圖8 顯示了不同序列數(shù)下3 個Alpha 多樣性指數(shù)（物種數(shù)，Chao1 指數(shù)與Shannon指數(shù)）的稀釋曲線（Rarefaction curve）。其中，3 個不同的Alpha 多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出了相似的趨勢。分析結(jié)果顯示，不同減氮處理下微生物群落Alpha多樣性差異不明顯，而菌劑的添加則能夠較明顯地影響土壤微生物群落Alpha 多樣性。其中，低濃度的菌劑添加下土壤微生物群落多樣性要明顯低于中高濃度菌劑添加下微生物多樣性。該結(jié)果表明中高水平的菌劑添加有助于土壤微生物群落多樣性的提升。

篩選出對核心變量作物產(chǎn)量有顯著影響（Plt;0. 05）的447 個OTU，并按照OTU 相對豐度對作物產(chǎn)量的影響，由高到低排序，結(jié)果如圖9 所示。由圖9 可知，對作物產(chǎn)量有積極影響的OTU，其豐度大多與土壤堿化度和土壤全鹽含量呈負相關(guān)；對作物產(chǎn)量有消極影響的OYU，其豐度大多與土壤含水率和土壤有機質(zhì)含量呈正相關(guān)。對作物產(chǎn)量有積極影響的部分OTU 可能能夠通過有效降低土壤堿化度和含鹽量，進而有促進植物生長；而對作物產(chǎn)量有一定消極影響的OTU 則可能通過降低土壤含水率和有機質(zhì)含量，增加土壤堿化度，進而對植物生長產(chǎn)生消極影響。以上結(jié)果說明，菌劑的施加可以通過影響土壤微生物群落中各菌株豐度，從而一定程度影響土壤理化性質(zhì)并提高作物產(chǎn)量。最后基于該分析，進一步篩選出了在作物增產(chǎn)中可能起到關(guān)鍵性作用的4 個OUT（皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）gt;0. 866，即R2gt;0. 75），分別為OTU_7192，OTU_1039，OTU_1995，OTU_2580。其中OTU_7192，OTU_1039 和OTU_2580 分別屬于拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae），浮霉菌門（Planctomycetes）未分類屬Pir4_lineage 和綠彎菌門（Chloroflexi）未分類屬KD4-96，而OTU_1995 為未鑒定OTU。對作物產(chǎn)量影響最大的為拜葉林克氏菌科（Beijer?inckiaceae）的OTU_7192。拜葉林克氏菌科是土壤中的重要固氮菌，可以將大氣中的氮氣還原成氨和其它含氮化合物，使氮元素進入土壤供植物生長所需。此外有研究表明該科菌株（Beijerinck?ia fluminensis）是一類菌劑植物促生長細菌，可以溶解磷元素、釋放IAA、鐵載體等植物生長調(diào)劑物質(zhì)，促進植物生長。同時，研究表明該菌株對包括尖孢鐮刀菌在內(nèi)的鏈格孢菌（Alternaria alterna?ta）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等病原菌均有拮抗能力，在干旱、重金屬等脅迫環(huán)境下提高小麥的發(fā)芽率、生物量和葉片色素含量［16］。

3 討論

本研究中，施用微生物菌肥后，即使氮肥減量30 %，向日葵的產(chǎn)量仍高于對照組，這是因為一方面施用微生物菌肥可以顯著增加土壤中向日葵生長所需養(yǎng)分的含量［17］；另一方面，微生物通過固氮、解鉀解磷等過程改變土壤中養(yǎng)分的存在形式［18-20］，提高向日葵對土壤養(yǎng)分的吸收效率，因此施用微生物菌肥后可適量減少氮肥的用量。然而，當?shù)蕼p量達到45% 時，向日葵的產(chǎn)量受到明顯抑制，表明此時微生物菌肥對氮肥的補償作用已不能滿足向日葵生長所需，因此后續(xù)的生產(chǎn)過程中，氮肥減量不宜超過45%。

總體而言，施用微生物菌肥后，不同減氮梯度處理的土壤含水率要高于對照組，這表明微生物可以改善土壤膠質(zhì)狀況，增強土壤吸附能力，提高土壤保水能力［21］。本試驗中，施用微生物菌肥處理的土壤堿化度較對照組有明顯的降低，整體上全鹽含量也呈下降趨勢，這是由于微生物代謝過程中分泌的酶類等物質(zhì)促進土壤團粒形成，改善土壤透氣性，減少土壤水分蒸發(fā)帶來的返鹽作用［22-24］；此外，菌肥中的嗜鹽菌可大量吸收土壤中的多余鹽分，從而降低土壤全鹽含量［25-26］。施用為生物菌肥后，土壤的pH 并未發(fā)生顯著變化，這可能與試驗周期較短有關(guān)，需要后續(xù)實驗繼續(xù)驗證。

微生物群落的數(shù)據(jù)表明，施用微生物菌肥可以顯著提高土壤的微生物群落數(shù)量，減氮處理會導(dǎo)致微生物群落多樣性降低，而施用高濃度微生物菌肥對微生物群落多樣性的影響遠大于減氮處理，因此，減施氮肥時，適量增加微生物菌肥的施用量可保證土壤中的微生物群落多樣性維持較高水平。OTU 分析的結(jié)果證實，微生物菌肥中含有的拜葉林克氏菌科等固氮菌是影響向日葵產(chǎn)量的關(guān)鍵菌種，這也是微生物菌肥可以代替部分氮肥效果的主要原因。

4 結(jié)論

施用微生物菌肥可以替代部分氮肥的作用，但氮肥的削減量不宜超過45%。微生物菌肥可以顯著降低土壤的堿化度及全鹽含量，并有效提升土壤微生物群落多樣性。微生物菌肥中的拜葉林克氏菌科等固氮菌對向日葵的產(chǎn)量有關(guān)鍵影響，可作為未來研究的重點。