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    鎘對(duì)豌豆根邊緣細(xì)胞和早期幼根生長(zhǎng)的毒害

    2023-04-25 00:00:00李宏鑫王立印楊婧怡王成龍王子然馬金虎
    關(guān)鍵詞:毒害豌豆

    關(guān)鍵詞:鎘脅迫; 豌豆; 根邊緣細(xì)胞; 幼根; 毒害

    中圖分類號(hào):S529 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1671-8151(2023)03-0068-08

    鎘(Cd2+)是劇毒重金屬元素之一,1984 年聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署將鎘列于“ 危害全球環(huán)境的化學(xué)物質(zhì)和化學(xué)過(guò)程清單”的首位[1]。中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中很多地區(qū)土壤普遍存在鎘超標(biāo)問(wèn)題[2-4]。土壤中的鎘很容易被植物吸收,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成一系列的傷害,如破壞光合色素,抑制植物光合速率[5],影響植物對(duì)Ca、Mg、Fe 等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收等[6-7]。鎘隨食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)可形成鎘硫蛋白,選擇性地蓄積在肝、腎中,排出速度很慢,容易引起骨骼變形、致癌等,嚴(yán)重威脅人體健康[8]。

    鎘主要通過(guò)被植物根吸收進(jìn)入植株。根邊緣細(xì)胞(root border cell, RBC)是從根冠表皮游離出來(lái)并聚集在根尖周圍的一群特殊細(xì)胞。RBC 從根表皮游離出來(lái)后,其代謝活性上升、基因表達(dá)明顯不同于根冠細(xì)胞。RBC 能特異性地合成、分泌一系列化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)根際環(huán)境,抑制或促進(jìn)根際周圍生物因子的活動(dòng),抵御外界有毒物質(zhì)如鋁、鎘等對(duì)根尖的傷害[9-12]。王亞男等[13]研究發(fā)現(xiàn),鎘對(duì)綠豆根邊緣細(xì)胞和根尖有毒害作用,根尖受到鎘脅迫時(shí),可釋放更多根邊緣細(xì)胞,并通過(guò)RBC 黏膠層增厚螯合有毒物質(zhì)、程序性凋亡等方式來(lái)抵御Cd2+ 對(duì)根尖的毒害。張賢仕[14]研究發(fā)現(xiàn),鎘脅迫對(duì)豌豆RBC 有致死效應(yīng),且對(duì)豌豆幼根產(chǎn)生顯著的傷害,這種傷害主要表現(xiàn)在根去除RBC 后,豌豆幼根抗氧化酶活性升高,根系活力顯著降低,而未除去RBC 的幼根受傷害程度較輕。本研究以豌豆為受體植物,較系統(tǒng)地研究了鎘脅迫對(duì)豌豆RBC 及幼根的傷害,從細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)層面解析了鎘對(duì)豌豆幼苗早期生長(zhǎng)的脅迫傷害機(jī)制,為豌豆避鎘栽培提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    供試材料為中豌6 號(hào),購(gòu)于山西省晉中市太谷縣當(dāng)?shù)胤N子公司。氯化鎘(CdCl2)購(gòu)于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

    1. 2 材料培養(yǎng)及處理

    挑選適量均勻飽滿的豌豆種子,0. 1% HgCl2消毒5 min,用去離子水洗去殘液,將種子用干凈的濕毛巾包裹,放于瓷盤中,置25 ℃ 培養(yǎng)箱中催芽。種子露白后,挑選萌發(fā)生長(zhǎng)一致的種子待用。取20 個(gè)直徑100 mm、高50 mm 的PVC 塑料管,將消毒的單層紗布用橡皮筋固定在管口上。將露白的種子置于紗布上,上蓋3 層濕紗布,將PVC 塑料管轉(zhuǎn)入加有適量去離子水的發(fā)芽盒蓋子上,將發(fā)芽盒移入25 ℃人工氣候箱中進(jìn)行根懸空培養(yǎng)。待根長(zhǎng)至5~10 mm 時(shí),將20 個(gè)PVC 塑料管分為4 組(4 個(gè)處理)。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)置1、2、5μmol·L-1 Cd2+水溶液對(duì)根進(jìn)行噴霧處理,每隔6 h噴1 次,共3 次。對(duì)照噴去離子水。待對(duì)照根長(zhǎng)至約20~25 mm 時(shí),進(jìn)行如下處理:(1)不同處理分別取5 個(gè)幼根,剪取10 mm 根尖,AO-EB 復(fù)合染液染色,進(jìn)行根尖原位觀察拍照;另取30 個(gè)根尖用于測(cè)定根冠果膠甲基酯酶(PME)活性。(2)不同處理取適量根尖,測(cè)定根長(zhǎng),根超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性,根H2O2、丙二醛(MDA)、超氧陰離子(O2ˉ ?)含量,根活性氧(ROS),根系活力,根細(xì)胞膜透性等生理指標(biāo),DAB、NBT、ROS 染色觀察拍照。(3)不同處理取30 個(gè)根尖,制備根邊緣細(xì)胞懸液,統(tǒng)計(jì)根邊緣細(xì)胞數(shù)量。

    同上述根懸空培養(yǎng)的方法,不進(jìn)行鎘脅迫處理,待根長(zhǎng)至約20~25 mm 時(shí),剪取200 個(gè)根尖,制備根邊緣細(xì)胞的MS 懸液,設(shè)置0、1、2、5 μmol·L-1Cd2+進(jìn)行RBC 離體培養(yǎng)。鎘脅迫培養(yǎng)6 h 后,測(cè)定RBC 存活率、凋亡率、黏膠層厚度。

    1. 3 指標(biāo)測(cè)定與方法

    根尖原位觀察和RBC 數(shù)量、存活率測(cè)定:參考胡忠良等[15]的方法。每個(gè)處理挑選約30 個(gè)生長(zhǎng)一致的根,剪取5 mm 長(zhǎng)根尖于盛有2 mL 1 mol·L-1MS 培養(yǎng)液的離心管中,振蕩器振蕩30 s,吸出細(xì)胞懸液,再用0. 5 mL MS 培養(yǎng)液沖洗2 次根尖。收集細(xì)胞懸液,用1 mL 微量注射器抽打3 次,使成團(tuán)的邊緣細(xì)胞分散開。將細(xì)胞懸液在4 ℃ 下500 r·min-1 離心2 min,棄去部分上清液,獲得分散均勻、濃度適宜的細(xì)胞懸液備用。取30 μL 不同處理的RBC 懸浮液,加入20 μL AO-EB 復(fù)合染液(AO∶EB=1∶1),避光染色1 min 后,在OlympusBX 53(U-RFL-T)熒光顯微鏡(藍(lán)色激發(fā)光)10 倍鏡下觀察拍照。每處理選取10 個(gè)視野拍照,統(tǒng)計(jì)RBC 總數(shù),活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量(活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,死細(xì)胞呈橘紅色或紅色熒光)。每處理切取10 個(gè)根尖置載玻片上,滴加少量AO-EB 復(fù)合染液立即在顯微鏡下觀察拍照。

    RBC 凋亡率的測(cè)定:取30 μL RBC 懸液,加入30 μL Hochest-33258 染液,暗處染色5 min 后,在紫外UV 激發(fā)光下觀察活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征并計(jì)數(shù)[16]。

    RBC 黏膠層厚度的測(cè)定:取30 μL RBC 懸液,加30 μL 的墨汁混勻,吸取30 μL 在普通光源下顯微觀察拍照。不同處理選取10 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行RBC黏膠層厚度的測(cè)量,每個(gè)細(xì)胞測(cè)3 個(gè)不同位置取其平均值[17]。

    根冠果膠甲基酯酶(PME)活性測(cè)定:參照馬金虎等[18]的方法,不同處理隨機(jī)剪取30 個(gè)約5 mm的根尖,加入400 μL PME 提取液,冰浴研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中,再用400 μL PME 提取液清洗研缽1 次,合并入離心管中,置于4 ℃ 冰箱中,每隔20 min 振蕩1 次,1 h 后,4 ℃ 15 000 r·min-1 離心10 min。取300 μL 酶液加入4 mL PME 反應(yīng)液,37 ℃水浴2 h,525 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PME 活性。

    SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量測(cè)定分別采用氮藍(lán)四唑還原法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和硫代巴比妥酸法測(cè)定,根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定,H2O2 含量采用分光光度法測(cè)定[19]。O2ˉ·含量參照李光忠[20]的方法測(cè)定。利用DDS-II 型電導(dǎo)儀測(cè)定根細(xì)胞膜透性。

    二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色:細(xì)胞顆粒中的過(guò)氧化物酶,能將H2O2 中的氧釋放出來(lái),氧化DAB,形成金黃色沉淀從而定位過(guò)氧化物酶活性的部位,金黃色沉淀越深,說(shuō)明此處累積的H2O2 越多[21]。將不同處理的豌豆幼根浸泡在DAB 染液中,置于光下,染色培養(yǎng)4 h 后取出,用去離子水沖洗3~5 遍,在體視顯微鏡下以同一參數(shù)條件進(jìn)行觀察拍照。

    ROS 熒光探針染色:采用北京盒子生工科技有限公司生產(chǎn)的活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色測(cè)定。植物體內(nèi)活性氧是植物體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子團(tuán)如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等的總稱。2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)本身沒(méi)有熒光,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后,被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2',7'-二氯二氫熒光素(DCFH),而DCFH 不能透過(guò)細(xì)胞膜,從而使探針易于裝載至細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH 生成有熒光的2',7'- 二氯熒光素(DCF)。綠色熒光的強(qiáng)度與活性氧的水平成正比。

    氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)染色:超氧陰離子自由基(O2ˉ·)能將NBT 還原成不溶于水的藍(lán)色甲臜,可定位O2ˉ·的產(chǎn)生部位。對(duì)植物根尖染色后,有O2ˉ·產(chǎn)生的部位會(huì)呈深藍(lán)色或藍(lán)紫色,其它部位近無(wú)色或者呈植物本身的色素。所有指標(biāo)測(cè)定均3 次重復(fù)。

    1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

    采用Microsoft Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,GraphPad Prism8 軟件作圖,Adobe Photoshop2019 CC 進(jìn)行輔助繪圖,SPSS 23. 0 軟件對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行比較(Duncan 法),顯著水平均為Plt;0. 05。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 Cd2+脅迫對(duì)豌豆RBC數(shù)量和PME活性的影響

    從圖1A 可以看出,鎘脅迫抑制豌豆RBC 的數(shù)量,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),隨著Cd2+濃度的升高,附著在根尖表面的RBC 數(shù)量逐漸減少,部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫處理后,與對(duì)照比,單株豌豆RBC 數(shù)量分別降低了15. 42% 和32. 17%(圖1B)。1、2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫處理,根尖PME 活性顯著升高,分別比對(duì)照升高15. 53%、21. 59% 和25. 76%(圖1C)。

    采用RBC 離體培養(yǎng)的方法(圖2A、2C、2E)研究發(fā)現(xiàn),Cd2+脅迫誘導(dǎo)豌豆RBC 凋亡、死亡,RBC黏膠層增厚。1、2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫,RBC 存活率分別比對(duì)照降低7. 42%、14. 29% 和42. 30%(圖2B)。RBC 凋亡率分別比對(duì)照高40. 53%、160. 61% 和306. 60%(圖2D)。RBC 黏膠層厚度分別比對(duì)照增加55. 40%、148. 74% 和248. 21%(圖2F)。

    2. 2 Cd2+脅迫對(duì)豌豆根尖活性氧、過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量的影響

    由圖3 可見(jiàn),Cd2+脅迫誘導(dǎo)根尖活性氧積累、過(guò)氧化氫和超氧陰離子含量升高。用DAB 對(duì)根尖進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),隨著Cd2+濃度升高,根尖染色越深,H2O2 積累越多(圖3A)。定量測(cè)定,5 μmol·L-1Cd2+脅迫下,根尖H2O2含量比對(duì)照升高了13. 04%(圖3B);用NBT 對(duì)根尖進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),隨著Cd2+脅迫增加,根尖染色越深,超氧陰離子含量增加(圖3C),定量測(cè)定,1、2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫下,根中超氧陰離子含量分別比對(duì)照升高了22. 99%、44. 16% 和51. 82%,均達(dá)顯著差異(圖3D);用ROS 熒光探針對(duì)根尖染色發(fā)現(xiàn),隨著Cd2+濃度升高,根尖藍(lán)色熒光亮度增強(qiáng)( 圖3E)。2、5μmol·L-1 Cd2+脅迫,根尖ROS 熒光強(qiáng)度分別比對(duì)照升高了16. 18% 和44. 37%(圖3F)。

    2. 3 Cd2+脅迫對(duì)豌豆根尖抗氧化酶活性的影響

    圖4 結(jié)果表明,鎘脅迫誘導(dǎo)豌豆根尖抗氧化酶活性增強(qiáng)。1、2、5 μmol·L-1 Cd2+ 脅迫,SOD 活性分別比對(duì)照升高39. 71%、46. 51% 和53. 91%(圖4A),POD 活性分別比對(duì)照升高19. 99%、24. 16%和35. 92%(圖4B)。2、5 μmol·L-1 Cd2+ 脅迫,CAT 活性分別比對(duì)照升高24. 42% 和38. 70%(圖4C)。

    2. 4 Cd2+脅迫對(duì)豌豆根尖細(xì)胞膜透性的影響

    從圖5 可知,隨鎘脅迫濃度增加,根尖MDA含量升高,根尖膜透性增大。1、2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫,根尖MDA 含量分別比對(duì)照增加140. 67%、155. 98% 和161. 24%(圖5A)。2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫,根尖相對(duì)電導(dǎo)率分別比對(duì)照升高13. 32% 和31. 81%(圖5B)。

    2. 5 Cd2+對(duì)豌豆幼根根系活力及根長(zhǎng)的影響

    由圖6 可知,鎘脅迫顯著抑制豌豆幼根的根系活力及幼根生長(zhǎng),鎘離子濃度越高抑制作用越強(qiáng)烈。與對(duì)照相比,1、2、5 μmol·L-1 Cd2+脅迫,豌豆根系活力與對(duì)照比分別降低4. 81%、13. 00% 和17. 32%(圖6C)。幼根的根長(zhǎng)分別比對(duì)照減少18. 32%、26. 81% 和41. 41%(圖6A、圖6B)。

    3 討論

    當(dāng)植物根遭受土壤中有害物質(zhì),如化感物質(zhì)和鋁、鎘脅迫時(shí),根邊緣細(xì)胞會(huì)迅速向胞外釋放多種化學(xué)物質(zhì),進(jìn)一步增厚黏膠層,吸附并螯合有毒物質(zhì),緩解有害物質(zhì)脅迫對(duì)植物根的傷害[18,22-23]。王亞男[13]報(bào)道,200 μmol·L-1 Cd2+ 誘導(dǎo)綠豆黏膠層顯著增厚。本研究和其相似,豌豆根尖黏膠層厚度與Cd2+ 濃度呈正相關(guān),這可能是根邊緣細(xì)胞在有毒物質(zhì)下的一種應(yīng)激保護(hù)現(xiàn)象。鎘誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞壁中的PME 活性升高,相關(guān)基因上調(diào),果膠去甲酯化程度上升,根邊緣細(xì)胞數(shù)量增加[13,24]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著Cd2+ 濃度的增加,豌豆根尖PME 活性不斷增加,這可能是因?yàn)殒k誘導(dǎo)豌豆根尖細(xì)胞壁中PME 相關(guān)基因的表達(dá),提高PME 活性以釋放更多RBC 抵御鎘脅迫。但本研究中RBC 數(shù)目隨著Cd2+濃度增加不斷減少,這與王亞男[13]的研究結(jié)果相反,造成這種結(jié)果的原因可能是隨著Cd2+ 濃度增加,豌豆根尖組織受損加劇,產(chǎn)生邊緣細(xì)胞的能力不斷下降。重金屬誘導(dǎo)根邊緣細(xì)胞的凋亡死亡。李榮峰等[25]研究發(fā)現(xiàn),鎘誘導(dǎo)大豆根邊緣細(xì)胞死亡;梁劍等[26]報(bào)道,鎘誘導(dǎo)麻瘋樹根邊緣細(xì)胞存活率下降至45%~60%。從本研究結(jié)果看,隨著Cd2+濃度的升高,豌豆根邊緣細(xì)胞存活率不斷降低、凋亡死亡率不斷升高,表明鎘對(duì)豌豆根邊緣細(xì)胞的傷害存在劑量性依賴。

    鎘脅迫引起植物氧化脅迫傷害,導(dǎo)致植物組織體內(nèi)膜脂過(guò)氧化、抗氧化系統(tǒng)代謝水平活躍,活性氧、MDA 含量升高。SOD、POD、CAT 活性增強(qiáng),清除細(xì)胞內(nèi)活性氧,維持機(jī)體內(nèi)活性氧平衡,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[27]。Zabka A 等[28]和Tamás 等[29]報(bào)道,鎘脅迫誘導(dǎo)根尖活性氧的積累,造成大麥、蠶豆等植物根尖細(xì)胞發(fā)育異常、根系活力降低、根長(zhǎng)變短。張珂[30]研究發(fā)現(xiàn),10 μmol·L-1的Cd2+ 顯著誘導(dǎo)了小麥抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性的提高。此外,鎘會(huì)造成小麥、蠶豆、土豆等植物體內(nèi)MDA 的積累[31-33]。從本研究結(jié)果看,鎘造成豌豆幼根中活性氧的積累,隨著Cd2+濃度的升高,豌豆幼根的ROS 含量增加,其中H2O2和O2ˉ·含量顯著增加,活性氧積累造成了豌豆幼根中抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性的升高;Cd2+造成豌豆幼根膜脂過(guò)氧化,其中MDA 含量顯著升高,細(xì)胞膜透性增加。隨著Cd2+濃度的增加,幼根的根系活力不斷下降,根長(zhǎng)變短。這與前人的研究結(jié)果一致。

    本研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下根邊緣細(xì)胞對(duì)豌豆幼根具有一定的保護(hù)作用。由于邊緣細(xì)胞是附著在根冠外的特殊細(xì)胞,因而能夠較容易洗下邊緣細(xì)胞,得到較純凈的豌豆幼根。同時(shí),本研究也有一些需要完善的地方。我們將繼續(xù)探究去除和未去除邊緣細(xì)胞對(duì)鎘脅迫下豌豆根尖組織結(jié)構(gòu)的影響;同時(shí)探究鎘對(duì)邊緣細(xì)胞及幼根細(xì)胞壁成分的影響及相關(guān)基因的表達(dá),以更深入地解釋邊緣細(xì)胞對(duì)根的保護(hù)機(jī)制。

    4 結(jié)論

    鎘對(duì)豌豆根邊緣細(xì)胞產(chǎn)生脅迫,降低其對(duì)豌豆根尖的保護(hù),進(jìn)一步造成豌豆幼根活性氧積累、膜脂過(guò)氧化、抗氧化酶活性升高、根系活力減弱、根長(zhǎng)變短,且豌豆根邊緣細(xì)胞和幼根受損程度隨鎘的濃度升高而升高。

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