miR-34a-5p模擬物與KRASG12C抑制劑ARS-1620協(xié)同用藥對非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移效果的研究

龐曉曉 袁浩棟 王輝 徐國新

[關(guān)鍵詞]微小RNA-34a-5p；間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子；ARS-1620；轉(zhuǎn)移；非小細胞肺癌

肺癌是全球范圍內(nèi)常見腫瘤，發(fā)病率位列所有腫瘤第三位，其中非小細胞肺癌（non-small-celllungcancer，NSCLC）是其最常見的組織學(xué)類型，現(xiàn)已構(gòu)成嚴重的全球健康問題[1-2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類對基因表達有調(diào)節(jié)作用的非編碼小分子RNA，其主要調(diào)控靶基因蛋白表達從而調(diào)節(jié)增殖、凋亡等多種細胞生物學(xué)功能[3-5]。據(jù)分析，miR-34a和miR-4664-3p、let-7a-2-3p等miRNAs聯(lián)合使用顯著抑制腫瘤增殖[6]。在抗NSCLC腫瘤細胞轉(zhuǎn)移方面，miR-34a與多種藥物協(xié)同作用效果顯著。KRAS基因突變被認為是NSCLC的預(yù)后不良因素，其中G12C位點突變約占14%[7-8]。因此臨床已將KRASG12C作為一個極好的肺癌治療靶點。KRASG12C抑制劑ARS-1620是一種快速持續(xù)占據(jù)靶點的高效價共價化合物，它通過抑制KRASG12C激活從而阻斷RAS-RAF-MEK-ERK信號傳遞，在小鼠移植瘤模型中已證實其抑制人類胰腺癌和結(jié)直腸癌細胞系生長的能力[9]。由此，本研究將探究miR-34a通過調(diào)控靶基因與ARS-1620協(xié)同作用時對KRASG12CNSCLC轉(zhuǎn)移的影響，為臨床治療KRASG12CNSCLC提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC細胞株：H2030與人正常肺上皮細胞Beas-2b均購于中國上海富衡細胞庫。miR-34amimic（miR10000255-1-5）由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成，Lipo2000（11668027）購于Invitrogen；ARS-1620（S8707）購于SELLECK生物科技有限公司；4%多聚甲醛（P0099）和結(jié)晶紫染液（C0121）購于碧云天生物技術(shù)有限公司；PCR試劑盒等（RR820A，638315）購于TaKaRa生物技術(shù)有限公司。MET（8198S）、β-actin（3700T）抗體等購于賽信通生物試劑有限公司（CST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將含10%胎牛血清的DMEM完培于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。將ARS-1620[溶于二甲基亞礬（DMSO）中]直接滴加于培養(yǎng)基，工作濃度為300nM。轉(zhuǎn)染過程是分別將濃度0、50、100、150nM的miR-34a-5pmimic和Lipo3000分別加入120μlDMEM基培中，混勻室溫靜置20min后將緩慢加入已接種細胞的6孔板內(nèi)。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 DAVID（thedatabaseforannotation，visualizationandintegrateddiscovery）分析miR-34a靶基因調(diào)控功能。TCGA（thecancergenomeatlas）下載肺癌表達差異基因，R語言制作火山圖（篩選條件為foldchange=2，adj.P=0.001），GEO數(shù)據(jù)庫下載關(guān)于肺癌轉(zhuǎn)移的系列：GSE42407（篩選條件為|logFC|>1，adj.P<0.01）。

1.2.3 Transwell實驗 將細胞懸液200μl接種于Transwell上室中，下室加500μl培養(yǎng)基于24孔板并于培養(yǎng)箱孵育18～24h。將上下室培養(yǎng)基吸盡，加入4%多聚甲醛固定細胞，15min后再用結(jié)晶紫染色。

1.2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?將MET3UTR克隆至報告基因pmiR-RB-Report?的hRluc（海腎熒光素酶）基因下游，構(gòu)建雙報告基因載體（MET3UTR靶位點：51-57：CACTGCC，突變靶位點：51-57：CACTGCC）。將基因載體與miR-34amimic或陰性對照共轉(zhuǎn)染293T細胞并測定熒光素酶活性。

1.2.5 qRT-PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30s；循環(huán)40次；95℃5s；60℃30s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.6 （WesternBlot）WB 將上清注入電泳槽中，90V電泳1.5h，90V2h轉(zhuǎn)至PVDF膜，結(jié)束后用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，次日加入熒光素標記二抗，掃膜儀成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPadPrism7.0軟件及SPSS26.0進行圖片處理及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-34a抑制H2030轉(zhuǎn)移

qRT-PCR結(jié)果顯示：與人正常肺上皮細胞Beas-2b比較，H2030中miR-34a表達（0.13±0.10）下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.820，P=0.004）。見圖1A。Transwell實驗結(jié)果顯示：miR-34amimic組（1035.00±61.81）細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量低于空轉(zhuǎn)mock組（1321.00±107.50），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.931，P=0.039）。見圖1B。

2.2 生信分析篩選并驗證miR-34a靶基因

通過TargetScan、miRDB、PicTar預(yù)測miR-34a靶基因并交集得出125個基因（圖2A）。通過DAVID預(yù)測miR-34a靶基因涉及遷移功能（圖2B）。將來自TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌表達上調(diào)差異基因、GSE42407有關(guān)基因以及125個靶基因交集得出11個基因，分別為F2RL2、CCNE2、NRIP3、SEPT3、SEMA4B、ALDOA、BTBD11、ZFHX4、NAV1、JAG1、MET（圖2C～D）。

選擇MET進行下一步實驗，熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，相對于MET-WT+NC（1.00±0.07），MET-WT+miR-34a組相對熒光值下降（0.57±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.954，P=0.015），提示miR-34a負調(diào)控靶基因MET表達。見圖3A。qRT-RCR結(jié)果顯示：miR-34amimic（100nM）組（0.49±0.05）中METmRNA表達低于對照mock組（1.18±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.570，P=0.003）（圖3B）。WB結(jié)果顯示，miR-34amimic（100nM）（0.49±0.03）組中MET蛋白表達低于對照mock組（0.79±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.790，P=0.004，圖3C）。

2.3 過表達miR-34a聯(lián)合ARS-1620對H2030轉(zhuǎn)移的影響

為了探究聯(lián)合用藥的效果，本研究分為con組、mock+DMSO組、miR-34a-5pmimic組、ARS-1620組和miR-34a-5pmimic+ARS-1620組Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-34a-5pmimic+ARS-1620組（551.70±53.29）細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著低于mock+DMSO組（1421.00±28.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.020，P<0.05）。見圖4。

3 討論

臨床腫瘤治療中常表現(xiàn)出對藥物的耐藥性，多種藥物協(xié)同治療是臨床上的最優(yōu)選擇。miR-34a與其他藥物協(xié)同治療取得了一定效果，已有研究表明，治療肺癌可協(xié)同多個miRNAs同時靶向多個致癌因子，由此癌癥相關(guān)旁路同時被抑制，發(fā)生耐藥的概率降低[6]。IGF1R、mTOR抑制劑和ARS-1620組合可抑制KRAS突變下游PI3K-AKT和RAF-MEK-ERK信號通路的傳遞，并完全抑制S6磷酸化，誘導(dǎo)肺腫瘤消退[9]。miRNAs是一類對基因表達有調(diào)節(jié)作用的非編碼小分子核糖核酸，異常miRNAs通過其靶基因異常表達從而對細胞產(chǎn)生影響，導(dǎo)致許多疾病，如NSCLC[10-12]。miR-34a異常表達是NSCLC患者復(fù)發(fā)的不良預(yù)測因子，所以恢復(fù)miR-34a表達對于NSCLC治療方面具有一定效果[13-14]。miR-34a靶基因MET是除EGFR、ALK和ROS1之后在NSCLC中的另一個重要腫瘤驅(qū)動基因和治療靶點，抑制MET蛋白表達對治療NSCLC有一定效果[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在H2030中表達下降，當恢復(fù)miR-34a表達后顯著抑制MET表達并一定程度抑制癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，KRASG12C抑制劑ARS-1620聯(lián)合miR-34amimic共同作用于H2030可顯著抑制其遷移，效果顯著于單一使用miR-34amimic處理H2030。

綜上所述，將miR-34a和KRASG12C作為靶點是一種很有前景的治療方案。但NSCLC的發(fā)展涉及到復(fù)雜信號通路，需要和其他靶向藥物甚至是放化療整合到臨床治療方案中。如何將不同治療方案結(jié)合起來將是臨床的一個挑戰(zhàn)。