豬圓環(huán)病毒3 型TB Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測方法的建立和應(yīng)用

李 鵬，孫延舉，王寅彪，金前躍，梁曉曉，銀 梅，王選年，劉興友，王利平

（1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；5.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450002）

豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine circovirus 3，PCV3）是一種單鏈環(huán)狀DNA 病毒，基因組全長約2 000 bp，與 PCV1、PCV2、PCV4 同 屬 環(huán) 狀 病 毒 科（Circoviridae）環(huán)狀病毒屬（Circovirus）[1-2]。PCV3 有3個(gè)主要開放閱讀框（Open reading frame，ORF），分別為與病毒復(fù)制相關(guān)的ORF1、編碼衣殼蛋白的ORF2 和逃避宿主天然免疫反應(yīng)相關(guān)的ORF3[3-4]。該病毒已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，美洲、歐洲和亞洲的數(shù)十個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道在豬群中檢測到PCV3存在[5]。國內(nèi)學(xué)者通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，已有近30省市檢測到PCV3的流行[6-7]。該病毒可引起豬的皮炎和腎病綜合征、心臟和多系統(tǒng)炎癥、母豬繁殖障礙等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（Porcine circovirus associated diseases，PCVAD）[8]。前人研究結(jié)果顯示，PCV3 常與PCV2、豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）等混合感染[9-11]。還有報(bào)道指出，感染PCV3 的豬可能不表現(xiàn)出任何臨床體征[12]。混合感染和潛伏感染使得PCV3 臨床診斷難度提高，無法準(zhǔn)確制定防治策略，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成不利影響。因此，需要建立一種快速、靈敏、特異的PCV3檢測方法。

目前，主要通過病毒接種細(xì)胞進(jìn)行PCV3 分離培養(yǎng)，利用免疫學(xué)的方法對其診斷和病原學(xué)研究。陳秋艷等[13]分別以PCV3 豬陽性血清和PCV3 核衣殼蛋白（Cap）的小鼠多克隆抗體作為免疫熒光檢測法（IFA）的一抗，羊抗豬或羊抗鼠FITC-IgG 作為二抗，分析PK-15 細(xì)胞在接種病毒后的病毒增殖情況，通過IFA檢測方法，證實(shí)PCV3可以在PK15細(xì)胞中增殖；并在電子顯微鏡下觀察到病毒粒子，對其進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)今尚無用于檢測PCV3 的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅山東省獸醫(yī)協(xié)會和中國獸醫(yī)協(xié)會在2020 年分別發(fā)布了PCV3 常規(guī)PCR 檢測方法和基于TaqMan 探針的實(shí)時(shí)熒光定量（qPCR）檢測方法。TB Green 是熒光定量PCR常用的熒光指示染料，與DNA雙鏈結(jié)合后可發(fā)出熒光信號，同常規(guī)PCR 相比靈敏度更高，操作更加便捷，與TaqMan 法相比無需設(shè)計(jì)探針，檢測成本相對更低[14]。

由于PCV3 與PCV1、PCV2 基因同源性較高，通過比對PCV1、PCV2 與PCV3 全基因組序列，確定PCV3 特異性保守區(qū)域，設(shè)計(jì)針對PCV3 的特異性引物，以建立PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法，旨在為PCV3 的鑒別診斷和早期防控提供快速、可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 病料

豬瘟病毒（CSFV）、PRRSV、PPV、PCV2 和PCV3陽性病料均由新鄉(xiāng)學(xué)院動物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。待檢的132 臨床樣品為2021年1月—2022年1月采集自新鄉(xiāng)周邊豬場的疑似CSFV、PCV2、PRRSV 等感染發(fā)病豬脾臟、淋巴結(jié)等組織樣品，-20 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；PremixTaq酶、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、pMD19-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、TB Green ⅡqPCR 試劑、病毒核酸提取試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR 儀（Q5）、梯度PCR 儀、離心機(jī)購自Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購自Protein Simple公司；凝膠電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank 上獲得國內(nèi)外PCV3 流行株的全基因組序列（登錄號：MG778698.1），使用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列比對，確定高度特異且保守區(qū)域，利用Primer 5.0 軟件針對其設(shè)計(jì)1 對特異性引物PCV3-R-F（5′-TGCTACGAGTGTCCTGAAGA-3′）、PCV3-R-R（5′-CAATAGATTCCCACTCGGTC-3′），預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為125 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 病毒基因組核酸的提取

取適量有疑似PCV3 臨床癥狀的淋巴結(jié)樣品，加入1mL PBS 研磨，反復(fù)凍融3 次，按照TaKaRa 公司的病毒RNA/DNA 快速純化試劑盒操作說明提取病毒DNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以提取的疑似PCV3 臨床癥狀淋巴結(jié)DNA 為模板，使用引物PCV3-R-F 和PCV3-R-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段回收純化后連接到pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp+的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)菌液PCR 鑒定后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。使用微量分光光度計(jì)測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參考TB Green Premix ExTaqⅡ試劑盒的操作說 明，擴(kuò) 增 體 系：2×TB Green Premix ExTaqⅡ10 μL，PCV3-R-F（10 μmol/L）0.5 μL，PCV3-R-R（10 μmol/L）0.5 μL，ROX 0.4 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)加無菌水至20 μL。選取4.74×102—4.74×107拷貝/μL的PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行qPCR 試驗(yàn)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，64 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。依據(jù)反應(yīng)結(jié)果，建立PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 特異性試驗(yàn)

按照1.7 中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使用引物PCV3-R-F 和PCV3-R-R 對CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PCV3 DNA 或cDNA 以及ddH2O 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以確定建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法的特異性。

1.9 敏感性試驗(yàn)

以10 倍梯度稀釋101—109拷貝/μL 的PCV3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，按照1.7 中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，使用引物PCV3-R-F 和PCV3-R-R 對建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，并與PCV3常規(guī)PCR方法比對。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

分別選取4.74×104、4.74×105、4.74×106拷貝/μL的PCV3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，各做3 組重復(fù)。根據(jù)每個(gè)樣品組間或組內(nèi)的平均Ct值及變異系數(shù)進(jìn)行重復(fù)性判定。

1.11 臨床樣品檢測

使用建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法，對收集的132 份臨床樣品進(jìn)行PCV3 病原檢測，同時(shí)設(shè)置陰性對照（H2O）和陽性對照（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒）。根據(jù)陳秋艷等[13]分離PCV3 的方法，將PCV3 常規(guī)PCR檢測呈陰性、PCV3 TB Green ⅡqPCR檢測呈陽性的樣品接種PK15 細(xì)胞，待病毒增殖72 h 后，收獲病毒液，反復(fù)凍融3次后，提取病毒DNA，進(jìn)行PCV3常規(guī)PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

以PCV3 DNA 為模板，使用引物PCV3-R-F 和PCV3-R-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，有125 bp 的目的條帶（圖1），符合預(yù)期，雙酶切結(jié)果如圖2所示。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物同PCV3的同源性為100%。對鑒定正確的PCV3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使用超微量分光光度計(jì)測得質(zhì)量濃度為146.4 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為4.74×1010拷貝/μL，按1∶10的比例稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

圖2 PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of PCV3 standard plasmid by double digestion

2.2 PCV3 TB Green ⅡqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

選取4.74×107—4.74×102拷貝/μL 的PCV3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，采用1.7中的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，表達(dá)式為y=-3.134 lgx+ 34.772，其中R2=0.999，擴(kuò)增效率為108.5%（圖3）。各梯度樣品的擴(kuò)增曲線間距相當(dāng)，且呈現(xiàn)出典型的S形（圖4）。

圖3 PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒TB Green ⅡqPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 TB Green ⅡqPCR standard curve of PCV3 standard plasmid

圖4 PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒TB Green ⅡqPCR擴(kuò)增曲線Fig.4 TB Green ⅡqPCR amplification curve of PCV3 standard plasmid

2.3 PCV3 TB Green ⅡqPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

以CSFV、PRRSV、PPV、PCV2、PCV3 DNA 或cDNA以及ddH2O為模板，采用TB Green ⅡqPCR方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，僅有PCV3 出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，其余樣品均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR檢測方法具有良好的特異性（圖5）。

圖5 PCV3 TB Green ⅡqPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 TB Green ⅡqPCR specificity test results of PCV3

2.4 PCV3 TB Green ⅡqPCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

從圖6 可以看出，構(gòu)建的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢出限可低至10 拷貝/μL，PCV3 常規(guī)PCR 最低檢出限為104拷貝/μL（圖7），證明建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR方法具有良好的敏感性。

圖6 PCV3 TB Green ⅡqPCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 TB Green ⅡqPCR susceptibility test results of PCV3

圖7 PCV3常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Conventional PCR sensitivity test results of PCV3

2.5 PCV3 TB Green ⅡqPCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 PCV3 TB Green ⅡqPCR對臨床樣品檢測結(jié)果

采用建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法，對收集的132 份豬的臨床病料組織樣品進(jìn)行PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢 測，同 時(shí) 和PCV3 常 規(guī)PCR 進(jìn)行比較，檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，PCV3常規(guī)PCR 檢測出陽性樣品6 份，檢出率為4.55%；PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢出陽性樣品12 份，檢出率為9.10%。經(jīng)測序驗(yàn)證，均為PCV3 的基因組序列。表明建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法可有效檢測臨床樣品中的PCV3。

表1 PVC3 TB Green ⅡqPCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 TB Green ⅡqPCR repeatability test results of PCV3

表2 PCV3臨床樣品TB Green ⅡqPCR方法和常規(guī)PCR方法檢測結(jié)果Tab.2 Detection results of PCV3 clinical samples by TB Green ⅡqPCR method and conventional PCR method

2.7 PCV3接種PK15細(xì)胞病毒分離結(jié)果

將PCV3 常規(guī)PCR 檢測陰性、PCV3 TB GreenⅡqPCR 檢測陽性的樣品，取20 mg 加入1 mL PBS研磨，反復(fù)凍融3 次后，12 000 r/min 離心，取上清，用0.22 μm 一次性濾器過濾，待PK-15 細(xì)胞長至單層后，接種到PK15細(xì)胞，待病毒增殖72 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，反復(fù)凍融3 次，裂解細(xì)胞并12 000 r/min 離心收集細(xì)胞毒液。提取病毒DNA 進(jìn)行PCV3 常規(guī)PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，經(jīng)PCV3 常規(guī)PCR 未檢出的臨床樣品，在接種PK15 細(xì)胞培養(yǎng)后，PCV3 常規(guī)PCR檢測為陽性（圖8）。

圖8 PCV3接種PK15細(xì)胞PCR檢測結(jié)果Fig.8 PCR detection results of PCV3 inoculated PK15 cells

3 結(jié)論與討論

PCV3 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，自2016 年于美國發(fā)現(xiàn)PCV3 后，目前已在國內(nèi)外廣泛流行，由于尚無針對PCV3 的疫苗和藥物，使該病的防控難以有效執(zhí)行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PCV3 ?；旌细腥酒渌≡?，與多種疾病相關(guān)，如心臟和多系統(tǒng)炎癥、皮炎和腎病綜合征、繁殖障礙、呼吸道疾病和腹瀉等，且偶有無癥狀感染豬出現(xiàn)，使臨床確診PCV3 難度增加，對全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[15]。PCV3 除感染家豬外，還可在野豬、牛、驢等動物中傳播，增加了PCV3 的臨床診斷和防控難度[16-18]?；赑CV3 廣泛流行的現(xiàn)狀，考慮控制檢測成本和便于批量檢測，以在基層養(yǎng)殖場應(yīng)用和推廣，建立高效、特異、快速和經(jīng)濟(jì)有效的PCV3 檢測方法至關(guān)重要。

qPCR 是檢測病原體基因組DNA 的重要研究工具，可對動物體內(nèi)的病原體做定量分析，為疾病診斷提供支持[19]。qPCR 依據(jù)熒光產(chǎn)生方式不同分為2 種類型，分別為以TaqMan 探針為主的探針法和使用TB Green 等熒光染料的染料法[20]。熒光染料可與DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出熒光信號，未結(jié)合雙鏈的熒光染料無信號，并可通過設(shè)置熔解曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果是否具有特異性[21]。與探針法qPCR 相比，基于TB Green 的qPCR 檢測成本相對較低，可用于臨床診斷和批量樣品檢測。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如YIN 等[22]建立了針對非洲豬瘟病毒A137R基因的SYBR Green ⅡqPCR 方法；KNIGHT等[23]針對可引起甜菜褐斑病的甜菜尾孢菌建立了探針法qPCR。

本研究對PCV1、PCV2、PCV3 全基因組序列進(jìn)行比對，選取PCV3特異性保守區(qū)域設(shè)計(jì)qPCR 特異性引物，建立PCV3 TB Green ⅡqPCR 檢測方法。建立的PCV3 TB Green ⅡqPCR 可特異性擴(kuò)增PCV3，與引起PCV3 相似癥狀的豬群常見病原體均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。該qPCR 檢測方法的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，是PCV3常規(guī)PCR的1 000倍，同已報(bào)道的TaqMan 探針法qPCR[24]（11.80 拷貝/μL）和SYBR Green Ⅰ染料法qPCR[25]（42.40 拷貝/μL）相近，表明建立的qPCR 具有較高的靈敏度。在重復(fù)性試驗(yàn)中，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1%。此外，在132份豬臨床樣品檢測中，PCV3 TB Green ⅡqPCR的檢出率（9.10%）高于PCV3常規(guī)PCR（4.55%）。

綜上，本研究成功建立用于PCV3 檢測的TB Green ⅡqPCR 方法。該方法敏感性高，特異性好，可為PCV3 的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)監(jiān)測和防疫措施的制定提供技術(shù)支持。