赤羽病診斷技術(shù)研究進展

李 超，王素春，王楷宬，薛 峰，王玉英

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物安全風(fēng)險預(yù)警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3. 青島水族館，山東青島 266031）

赤羽?。ˋkabane disease ）又稱阿卡斑病，是由赤羽病病毒（Akabane disease virus，AKAV）感染牛羊，以懷孕母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎，以及胎兒畸形、新生仔畜關(guān)節(jié)彎曲、積水性無腦癥等為特征的一種蟲媒傳染病，蚊蟲和庫蠓是其主要傳播媒介[1]。我國將牛赤羽病列為三類動物疫病[2]。牛赤羽病也是《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中的二類傳染病，為口岸地區(qū)重點防范和檢疫的外來動物疫病。近年來，鄰近我國的韓國、日本赤羽病疫情頻發(fā)，給當(dāng)?shù)嘏Ｑ蝠B(yǎng)殖業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失。隨著全球化進程加快，動物及動物產(chǎn)品跨境流動頻繁，AKAV通過牛羊及其產(chǎn)品進口等途徑傳入我國的風(fēng)險不斷增大。同時，蚊蟲、庫蠓等傳播媒介的繁衍、增殖不再局限于特定區(qū)間，而是跨地區(qū)甚至跨洲流動，加上氣候環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)變化以及極端天氣增多，進一步加大了赤羽病傳入我國并在國內(nèi)傳播和擴散風(fēng)險。對赤羽病進行及時準(zhǔn)確診斷是控制其傳入、傳播和流行的關(guān)鍵，因此需要加強對赤羽病防控技術(shù)的研究和儲備。赤羽病診斷技術(shù)包括依靠觀察病理變化的臨床診斷以及依據(jù)實驗室檢測的病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。本文對赤羽病診斷技術(shù)研究進展進行分析和綜述，以期為建立赤羽病現(xiàn)場即時檢測方法以及制定赤羽病診斷技術(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 臨床診斷

1.1 臨床癥狀

赤羽病臨床癥狀主要表現(xiàn)為，牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，以及胎兒畸形、新生胎兒先天性關(guān)節(jié)彎曲等。本病在非懷孕牛羊中多為隱性感染，在成年牛中也可表現(xiàn)腦脊髓炎等臨床癥狀?；颌裥虯KAV可導(dǎo)致牛腦脊髓炎，基因Ⅱ型僅引起懷孕牛羊繁殖障礙[3]。

1.2 病理變化

AKAV對胎兒的腦、脊髓和肌肉細胞有感染組織嗜性，出現(xiàn)的非炎性壞死可干擾細胞多形性分化[4]。AKAV感染首先導(dǎo)致新生犢牛、羔羊出現(xiàn)共濟失調(diào)，然后出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲和肌肉發(fā)育不良，最終出現(xiàn)腦積水和嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)病變。AKAV感染可造成神經(jīng)和肌肉病變，如非化膿性腦脊髓炎、局部腦退化性腦脊髓炎造成的腦穿孔、小腦癥、腦積水、腹角運動神經(jīng)元和軸突消失、脊髓運動神經(jīng)束髓磷脂減少，以及伴隨骨骼肌薄壁組織退化的肌管壞死和多發(fā)性肌炎，脊髓病變導(dǎo)致的脊柱側(cè)凸。同時，駝背和關(guān)節(jié)彎曲可能會影響全身所有骨骼關(guān)節(jié)[5]。用AKAV人工感染山羊和綿羊發(fā)現(xiàn)，感染羊出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲、積水性無腦畸形、駝背、脊柱側(cè)凸、頭小和腦穿通畸形、產(chǎn)死胎和流產(chǎn)。AKAV自然感染綿羊胎兒，會導(dǎo)致圍產(chǎn)期羔羊死亡或患先天性小腦癥。用AKAV人工感染母牛后發(fā)現(xiàn)，其胎兒畸形種類與妊娠期有關(guān)，妊娠后76～104 d常見積水性無腦畸形，103～174 d多見關(guān)節(jié)彎曲[6]。綿羊由于妊娠期較短，被感染胎兒可同時出現(xiàn)腦和骨骼病變。

1.3 鑒別診斷

根據(jù)臨床癥狀和病理變化可對赤羽病做出初步判斷，發(fā)現(xiàn)可疑病例時應(yīng)與可引起牛羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及先天性胎兒畸形等臨床癥狀的其他病毒（如施馬倫貝格病毒、裂谷熱病毒、藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、邊界病病毒等）感染做好鑒別診斷。

2 病原學(xué)診斷

2.1 病毒分離鑒定

病毒分離鑒定雖然是診斷赤羽病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，但在進出口檢疫、動物疫病監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查過程中很少采用。主要原因：一是病毒分離鑒定耗時較長，效率不高；二是AKAV為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，相對于DNA病毒，其自身穩(wěn)定性較差，容易失活，造成分離失敗。研究[8]表明，從疑似患病動物采集肝素抗凝血進行病毒分離的成功率較高，偶爾也可從流產(chǎn)胎兒組織中分離到病毒。AKAV可引起雞胚發(fā)育畸形，通過卵黃囊接種或乳鼠腦內(nèi)接種可分離病毒，可通過患病毒血癥的哨兵動物血漿或攜帶病毒的媒介生物白細胞中分離病毒，也可通過1～2日齡乳鼠腦內(nèi)接種待檢組織上清懸液分離病毒。常用哺乳動物傳代細胞系如MDBK、Vero、BHK-21和HmLu-1細胞系在37 ℃培養(yǎng)條件下進行病毒分離，也可采用昆蟲細胞C6/36在28 ℃培養(yǎng)條件下進行病毒分離[9]。一般需盲傳3代，直至可見明顯的細胞病變?？刹捎梅肿由飳W(xué)試驗、間接免疫熒光抗體試驗、免疫組化試驗或中和試驗進行分離病原的鑒定。

2.2 免疫組織化學(xué)試驗方法（immunohistochemistry，IHC）

IHC可采用胎牛和胎羊或用自然感染的新生小牛脊髓組織材料，用福爾馬林固定，過氧化物酶染色后可進行AKAV抗原檢測。免疫組織化學(xué)試驗一般試驗周期較長，不推薦用于基層現(xiàn)場赤羽病診斷。

2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

RT-PCR作為分子生物學(xué)方法中最簡單的方法，在赤羽病日常診斷檢測中應(yīng)用較為廣泛。AKAV的基因組由L、M、S3個基因片段組成，相較于L和M基因的多突變性，S基因相對保守，因此分子生物學(xué)方法一般將S基因作為AKAV核酸檢測的靶標(biāo)基因[10]。國內(nèi)有不少研究已建立了成熟的RT-PCR方法，其檢測限值可達1.0×109copies/μL，但與其他分子生物學(xué)檢測方法相比，RT-PCR方法的敏感性略低且耗時較長。

2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗方法（quantitative real-time PCR，qPCR）

qPCR具有操作簡便、特異性強、敏感性高等優(yōu)勢，比普通RT-PCR靈敏度高且無需電泳檢測，不僅能夠保障人員的職業(yè)健康安全，還可減少核酸檢測時間，是一種較為快速簡便的赤羽病病原學(xué)檢測技術(shù)。2015年，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布實施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病毒實時熒光RT-PCR檢測方法》（SN/T 3991—2014），首次將實時熒光RT-PCR（qRT-PCR）檢測方法納入赤羽病診斷技術(shù)范疇。馬玲等[11]針對AKAV的S基因建立了SYBR Green I qRT-PCR方法，其檢測限可達1.0×101copies/μL，同時具有較好的特異性和重復(fù)性，更適用于赤羽病傳播媒介蚊蟲、庫蠓等病毒載量較低樣品的病原檢測。孟錦昕等[12]建立了AKAV qRT-PCR方法，其檢測稀釋的病毒標(biāo)準(zhǔn)品限值可達到10-8，具有較好的敏感性和特異性，為赤羽病的早期診斷提供了技術(shù)支持。

2.5 反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試驗方法（reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）

RT-LAMP是具有獨特擴增模式的一種可視化核酸檢測方法，可肉眼直接判讀反應(yīng)結(jié)果，擴增反應(yīng)可在等溫條件下進行，不需要設(shè)備輔助，從核酸提取到結(jié)果判定，整個周期僅需1.5 h，檢測成本低，使用簡單，但其引物設(shè)計較為復(fù)雜。2018年，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布實施了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牛羊赤羽病病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法》（SN/T 4824—2017），首次將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法納入赤羽病的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。張吉紅等[13]建立了AKAV RT-LAMP檢測方法，其特異性良好，靈敏度可達11.5 copies/μL，采用SYBR Green I染色，肉眼即可判定檢測結(jié)果。魚海瓊等[14]建立了RT-LAMP檢測方法，其核酸檢測的最低檢測限為1.08 ng/μL，比RT-PCR靈敏度高出2個數(shù)量級。高峰等[16]利用LAMP技術(shù)的高特異性和敏感性等特點，嘗試與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，基于LAMP技術(shù)，建立了包括AKAV在內(nèi)的5種牛傳染病病原的新型高通量快速檢測基因芯片，其靈敏度可達102～105copies/μL，可實現(xiàn)高通量檢測。

2.6 實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫擴增試驗方法（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）

RT-RAA可在常溫條件下利用重組酶，在恒定溫度下使引物和模板DNA發(fā)生鏈置換反應(yīng)，反應(yīng)時間低于30 min，并通過熒光判定結(jié)果，具有引物設(shè)計簡單、反應(yīng)時間短、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點。宋瑞鵬等[21]首次建立了AKAV熒光RT-RAA方法，42 ℃反應(yīng)20 min即可快速檢測出AKAV核酸，檢測靈敏度可達6.26×101copies/μL，并且具有良好的特異性和重復(fù)性，為AKAV的現(xiàn)場快速即時檢測提供了可靠方法。

2.7 聚類規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列-關(guān)聯(lián)蛋白12a（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein，CRISPR-Cas12a）核酸檢測試驗方法

CRISPR-Cas12a核酸檢測試驗方法采用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，聯(lián)合便攜式檢測試劑條、便攜式熒光可視化系統(tǒng)或者超靈敏熒光傳感系統(tǒng)等生物傳感器，在滿足高敏感性和高特異性的同時具備了檢測高效、便捷的特點。一般須結(jié)合RT-RAA或者RT-LAMP技術(shù)進行核酸預(yù)擴增，相較于傳統(tǒng)AKAV核酸檢測技術(shù)，基于CRISPR/Cas12a技術(shù)的核酸檢測系統(tǒng)具有較多優(yōu)勢：操作簡單且便攜，不依賴于昂貴的設(shè)備和嚴(yán)苛的實驗條件，操作便捷的同時可達到理想的靈敏度和特異性，檢測所需時間較短，結(jié)果讀取簡單方便，通過熒光信號或肉眼即可進行結(jié)果讀取，相應(yīng)試劑可以凍干粉形式存放，便于保存和攜帶?；贑RISPR/Cas12a的AKAV熒光檢測方法在國內(nèi)尚屬于研究空白。唐浩等[17]基于CRISPR/Cas12a技術(shù)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試驗方法（RT-LAMP）建立了一種便攜式檢測新型布尼亞病毒方法，其最低檢測限可達25 copies/μL，在試紙條上顯示肉眼可見的信號，可在2 h內(nèi)可實現(xiàn)對新型布尼亞病毒的核酸檢測。

3 血清學(xué)診斷

3.1 膠體金免疫層析試驗方法（colloidalgold immunochromatography assay，GICA）

GICA以抗原抗體的特異性反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物或顯色劑，檢測時間通常只需10 min左右，且不需要設(shè)備和人員培訓(xùn)，其缺點是檢測靈敏度比分子生物學(xué)方法要低，僅可用于輔助診斷。孔玉方等[18]研制的牛赤羽病血清抗體膠體金檢測試紙，檢測靈敏度達1:512，特異性較好，僅可與AKAV 的N蛋白抗體牛血清反應(yīng)，可用于基層養(yǎng)殖戶的赤羽病初篩。楊素等[19]采用雙抗體夾心免疫層析技術(shù)，研制了適合田間快速試驗的AKAV膠體金免疫層析試紙條，其檢測限可達10 TCID50，特異性較強，還具有快速、穩(wěn)定、簡便等優(yōu)點，可用于赤羽病的大批量、田間快速初篩和現(xiàn)場快速診斷。

3.2 血清中和試驗方法（serum neutrlization test，SNT）

SNT是依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原理，將待檢牛羊血清按比例稀釋后，與確定含量的AKAV混合、孵育，作用一段時間后再接種到AKAV敏感細胞內(nèi)（如BHK-21或MDBK細胞），通過觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE）來判定血清陽性與否的血清學(xué)檢測方法。SNT特異性高，其缺點是容易受抗原純度、抗體效價和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清質(zhì)量影響，需要制備標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和微量病毒中和試驗抗原，且檢測時間較長，試驗成功的關(guān)鍵是抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的質(zhì)量。SNT是確定AKAV抗體陽性血清的標(biāo)準(zhǔn)方法。2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布實施農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病細胞微量中和試驗方法》（NY/T 549—2002），2007年SNT被列入《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）中。

3.3 瓊脂凝膠免疫擴散試驗方法（agar gel immunodiffusion test，AGID）

AGID依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原理，運用已知的AKAV抗原來檢測待檢樣品中的AKAV血清抗體，其操作簡便快速，尤其適應(yīng)于大量血清樣品的檢測，但其特異性較差，敏感性也較低，易出現(xiàn)假陽性問題，需要AKAV抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清[20]。該方法作為一種赤羽病輔助診斷的血清學(xué)檢測方法，被列入《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）中。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA既可以用來檢測AKAV抗原，也可以檢測AKAV抗體。因現(xiàn)階段我國尚無赤羽病相關(guān)疫苗可用，因此不管是AKAV抗原陽性還是抗體陽性結(jié)果均可正確、快速診斷赤羽病。在商品化診斷試劑方面，法國ID-Vet公司研發(fā)的ID Screen AKAV抗體檢測試劑盒[21-22]，是以純化的AKAV為包被抗原，以抗AKAV囊膜蛋白的單克隆抗體為競爭抗體所建立的競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，其敏感性可達96.52%，特異性可達98.83%，能夠?qū)崿F(xiàn)與施馬倫貝格病毒血清的鑒別檢測，是目前公認(rèn)的敏感性高、特異性強的AKAV抗體檢測試劑盒，被廣泛應(yīng)用于牛羊血清中的AKAV抗體檢測和赤羽病診斷。國內(nèi)也有不少單位正在進行AKAV ELISA試劑盒的研發(fā)工作。陳冬杰等[23]利用表達純化的N重組蛋白作為包被抗原，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗N蛋白單克隆抗體為競爭性抗體，通過對反應(yīng)條件不斷優(yōu)化，最終建立了AKAV N蛋白競爭ELISA抗體檢測方法。該方法采用N蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原包被酶標(biāo)板，可避免采用AKAV全病毒作為標(biāo)準(zhǔn)抗原包被酶標(biāo)板時，因滅活不徹底而產(chǎn)生的生物安全隱患，同時保留了檢測方法的敏感性和特異性[24]，為目前國內(nèi)臨床上赤羽病血清學(xué)監(jiān)測提供了技術(shù)手段。王建華等[25]采用表達的AKAV重組截斷囊膜蛋白（第407～614位氨基酸）包被酶標(biāo)板，優(yōu)化反應(yīng)條件建立了AKAV間接ELISA方法。該方法具有良好的特異性和重復(fù)性，對1:1 280稀釋的AKAV陽性血清仍可檢測出陽性；針對同樣樣品盤，該間接ELISA方法的陽性檢出率要高于SNT，但低于ID Screen AKAV抗體檢測試劑盒。間接ELISA方法的建立為血清樣品中AKAV抗體檢測提供了有效手段。

4 展望

AKAV是正布尼亞病毒屬中最重要的病原體，可在蚊蟲、庫蠓的腸道或唾液腺中復(fù)制，蚊蟲、庫蠓叮咬健康牛羊后，可將病毒通過血液傳播給新宿主，因此蚊蟲和庫蠓不屬于機械性傳播媒介。牛在發(fā)生病毒血癥3～4 d后出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)化，可檢測到AKAV抗體[26]。赤羽病暴發(fā)可對當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成較大經(jīng)濟損失，其暴發(fā)條件包括易感動物處于懷孕早期，某地區(qū)傳播媒介物數(shù)量激增（特別是在病毒已消失數(shù)年時）、降雨量激增等情況[27]。在赤羽病流行地區(qū)，高水平的母源抗體可防止胎兒被感染，但AKAV可在牛羊胎盤中長期持續(xù)性感染，一般發(fā)生在母羊妊娠后30～70 d及母牛妊娠后30～150 d[28]。當(dāng)牛羊出現(xiàn)關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦畸形等上述臨床癥狀和病理變化時，牛群和羊群發(fā)病率較高，傳播迅速，可判定為疑似赤羽病，但最終確診需要依靠實驗室診斷。

赤羽病的實驗室診斷技術(shù)主要包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷，其中病原學(xué)診斷主要檢測AKAV抗原或核酸，血清學(xué)診斷主要檢測牛羊血清中是否存在AKAV特異性抗體[29]。赤羽病是我國口岸重點監(jiān)測的跨境動物疫病，其實驗室檢測依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《赤羽病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1128—2007）、《赤羽病毒實時熒光RT-PCR檢測方法》（SN/T 3991—2014）和《牛羊赤羽病病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法》（SN/T 4824—2017）等。其中ELISA方法是我國檢疫進口牛羊赤羽病常用的血清學(xué)檢測方法[30]。但現(xiàn)階段我國對進境牛羊赤羽病檢疫嚴(yán)重依賴國外進口抗體檢測試劑盒，檢疫單頭份成本高。因此，開展赤羽病新型診斷技術(shù)和檢測方法研究，開發(fā)新的簡便、易行，具有高度特異性和敏感性，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化，且適宜于大規(guī)模篩查的赤羽病檢測方法，研制相應(yīng)的赤羽病診斷試劑，對于提高赤羽病的檢疫和監(jiān)測能力具有重要的實際意義[31]。

AKAV因其特殊的傳播途徑及感染方式，導(dǎo)致多數(shù)感染動物為隱性感染，不利于早期感染診斷，這大大增加了赤羽病防控難度。因此，除了研發(fā)特異性強、敏感性高的診斷試劑外，還要做好赤羽病疫苗的相關(guān)技術(shù)儲備。當(dāng)赤羽病形成暴發(fā)和流行時，疫苗可提供有效免疫屏障[32]。目前我國尚未系統(tǒng)開展家畜AKAV感染的持續(xù)性監(jiān)測工作，下一步應(yīng)加強赤羽病的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測預(yù)警。此外，還需要即時修訂赤羽病診斷相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，制定赤羽病暴發(fā)調(diào)查技術(shù)規(guī)范[33]，以滿足我國赤羽病防控的實際需要。