厚樸總黃酮提取及響應(yīng)面法優(yōu)化

劉小琳，魏麗婷，黃瑤雁，陳婉明，陳莎莎

（閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，福建泉州 362332）

中藥厚樸是取自木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸經(jīng)干燥后的干皮、根皮及枝皮。其藥性溫和、味苦且辛，無毒，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)。其功能為燥濕消痰，下氣除滿；主治痰飲喘咳，食積氣滯，脘痞吐瀉等[1]。厚樸在臨床上配方的中成藥高達(dá)200 種[2]，在我國已經(jīng)有2 00 多年的藥用歷史。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]可知，其主要含有苯丙素、木脂素、小分子酚醛酯、苷類化合物、揮發(fā)油、生物堿、黃酮類及其他化合物，在四川、湖北、湖南、浙江、安徽、福建等省均有種植?，F(xiàn)代藥理研究表明，厚樸具有廣譜抗菌、抗氧化、抗炎、抗?jié)?、抗腫瘤、抗凝血、保護(hù)心腦血管等作用[5-6]。

超聲波能產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)和高的加速度，進(jìn)而產(chǎn)生巨大的壓力、增大分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度，不僅加速了藥物中有效成分進(jìn)入溶劑，也加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放、擴(kuò)散及溶解，從而提高提取的效率，具有耗時(shí)短、提取率高、溶媒用量小等優(yōu)點(diǎn)[7]，廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、食品學(xué)、生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥等領(lǐng)域[8-10]。利用超聲波輔助乙醇浸提法提取厚樸總黃酮，以蘆丁作為對(duì)照品，采用比色法，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以總黃酮的提取量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法（RSM） 優(yōu)化總黃酮的提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

厚樸，產(chǎn)自四川；蘆丁，阿拉?。ㄉ虾＃?有限公司提供；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為分析純，西隴化工股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 厚樸總黃酮的提取

將厚樸置于60 ℃恒溫烘干至質(zhì)量不變，粉碎過篩（40 目），得到厚樸粉末，避光冷藏（8 ℃）備用。準(zhǔn)確稱取定量厚樸粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，200 W 超聲條件下，恒溫加熱一定時(shí)間后，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心15 min，取上清液作為提取液。

1.2.2 厚樸總黃酮的測(cè)定

測(cè)定總黃酮含量的方法采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[11]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（蘆?。?計(jì)算厚樸黃酮類物質(zhì)含量。其中擬合的回歸方程為：Y=0.012 7X-0.000 9，R2=0.999 5。

其公式為：

式中：W——總黃酮提取量，mg/g；

V——提取液體積，mL；

C——溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以總黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依次考查乙醇體積分?jǐn)?shù)55%～95%，料液比1∶5～1∶45（g∶mL），超聲溫度30～70 ℃，超聲時(shí)間20～60 min 四因素，分析各個(gè)因素對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)1.2.3 結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化水平[12]。選取4 個(gè)自變量分別是乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時(shí)間（D），選取響應(yīng)值是厚樸總黃酮提取量。

Box-behnken 因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-behnken 因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均采取平行重復(fù)3 次，響應(yīng)面采用Design Expert 11 設(shè)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響

在料液比1∶25（g∶mL），超聲功率200 W，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間40 min 超聲條件下，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)55%～95%對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，厚樸總黃酮提取量達(dá)到最大值為30.20 mg/g。可能是因?yàn)辄S酮化合物種類較多，極性范圍也比較廣，且乙醇在不同體積分?jǐn)?shù)下的極性也不同，75%乙醇溶液的極性與厚樸中總黃酮的極性比較相似，使得目標(biāo)產(chǎn)物比較容易溶入到溶劑中[13]。因此確定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75%。

2.1.2 料液比對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響

在75%乙醇的體積分?jǐn)?shù)，超聲功率200 W，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間40 min 條件下，考查料液比1∶5～1∶45（g∶mL） 對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響。

料液比對(duì)總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

當(dāng)料液比在1∶25（g∶mL） 時(shí)總黃酮提取量達(dá)到最大值為30.60 mg/g。這可能是由于料液比處于在1∶5～1∶25（g∶mL） 時(shí)，隨著溶劑的量的增大而升高；當(dāng)溶劑的量超過1∶25（g∶mL） 后，溶出的雜質(zhì)增多，會(huì)與樣品中溶出的黃酮產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性，致使總黃酮提取量下降[14]，故確定料液比為1∶25（g∶mL）。

2.1.3 超聲溫度對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響

在料液比1∶25（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，超聲功率200 W，超聲時(shí)間40 min 的條件下，考查溫度30～70 ℃對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響。

超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)獲得最高提取量，但當(dāng)溫度不斷的升高，提取量卻逐漸下降。這可能是當(dāng)溫度增加時(shí)，分子的運(yùn)動(dòng)也會(huì)加快，有利于總黃酮的溶出和擴(kuò)散，使得提取液中有更多的目標(biāo)產(chǎn)物；但隨著溫度的增加，也能使乙醇揮發(fā)速度加快，造成溶劑減少，影響總黃酮的溶出，也有可能是黃酮類成分被氧化毀壞，還可能致使其他可溶性物質(zhì)的溶出[15]，從而導(dǎo)致了提取量的變化。故確定超聲溫度為50 ℃。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響

在料液比為1∶25（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，超聲功率200 W，超聲溫度60 ℃超聲條件下，考查時(shí)間20～60 min 對(duì)目標(biāo)成分提取量的影響。

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

在超聲時(shí)間為40 min 時(shí)獲得最高提取量，但超過40 min 以后，提取量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間過短時(shí)，其黃酮類物質(zhì)還沒有被完全溶出，造成提取量比較低；當(dāng)超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，樣品中的黃酮類物質(zhì)也有可能被部分氧化分解，從而使提取的目標(biāo)產(chǎn)物提取量降低[16]。故確定超聲時(shí)間為40 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)提取方案。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 總黃酮提取量回歸模型方差分析

對(duì)表2 的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到總黃酮的二次回歸擬合方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

提取量回歸模型方差分析見表3。

由表3 可知，由模型p＜0.000 1 得知此模型具有極好的顯著性；模型決定系數(shù)R2=0.934 5，說明有93.45%的響應(yīng)值的自變量能被該模型解釋。失擬項(xiàng)p=0.396 8＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明此模型的擬合效果好，可對(duì)此回歸模型方程進(jìn)行檢驗(yàn)。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)總黃酮提取量的影響程度從大到小依次為超聲溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲時(shí)間。

表3 提取量回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

3D 響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以解釋自變量之間的相互作用和反映變量間相互作用。通過觀察曲面的傾斜度，確定兩者對(duì)響應(yīng)值的影響程度。

不同因素交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖（a） 及等高線圖（b） 見圖5。

圖5 不同因素交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖（a） 及等高線圖（b）

最高的響應(yīng)曲面傾斜度為溫度，說明最影響目標(biāo)成分含量為溫度。結(jié)果與方差分析結(jié)果符合（見表3）。AC等高線接近于圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。AC、BC響應(yīng)曲面較陡峭，等高線接近于橢圓，說明超聲溫度和料液比（AC）、超聲時(shí)間和料液比（BC） 的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。

2.3 工藝條件優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面優(yōu)化獲得乙醇體積分?jǐn)?shù)為76.78%，料液比為1∶28.2（g∶mL），超聲時(shí)間為41 min，超聲溫度為53.63 ℃，目標(biāo)成分含量預(yù)測(cè)值為31.946 mg/g。為了方便驗(yàn)證模型的有效性，取乙醇體積分?jǐn)?shù)為77%，料液比為1∶28.2（g∶mL），超聲時(shí)間為41 min，超聲溫度為54 ℃，在此工藝條件下得到目標(biāo)成分含量為32.30±0.65 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，說明該試驗(yàn)切實(shí)可行。

3 結(jié)論

乙醇體積分?jǐn)?shù)77%，料液比1∶28，超聲溫度54 ℃，超聲時(shí)間41 min，此條件下得到目標(biāo)成分含量為32.30±0.65 mg/g。通過響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定了超聲波輔助乙醇提取厚樸總黃酮的最佳控制點(diǎn)，證明經(jīng)RSM法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)較為實(shí)用可靠，為厚樸天然成分的有效提取利用提供參考價(jià)值。