鎖陽(yáng)黃酮對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬組織ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表達(dá)的影響

呂鑫 ，顧志榮 ，祁梅 ，郭燕 ，毛小文 ，葛斌

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為全面性認(rèn)知功能損傷[1]。調(diào)查顯示，我國(guó)60歲及以上人群中AD患者約占癡呆癥患者的65.23%，已成為我國(guó)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一[2]。AD主要病理表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑、Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)、炎癥反應(yīng)等[3]。研究表明，Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、AD等疾病的危險(xiǎn)因素，活性氧（ROS）是NLRP3炎性小體激活的經(jīng)典途徑[4]，NADPH氧化酶是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的關(guān)鍵酶，由膜亞基gp91phox、p22phox和胞漿亞基p47phox、p67phox等組成（phox表示來(lái)源于吞噬細(xì)胞）。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，上述亞基不具備活性；當(dāng)受到刺激后，各亞基在細(xì)胞膜上集合與裝配，形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體，催化生成大量ROS，進(jìn)一步激活NLRP3炎性小體，釋放炎癥因子[5]。因此，以NADPH氧化酶各亞基為切入點(diǎn)，減少ROS生成，進(jìn)而抑制炎癥因子釋放，可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD由腎精不足、腦髓漸空所致[6]。鎖陽(yáng)是中醫(yī)、蒙醫(yī)常用補(bǔ)腎益精藥，其有效部位鎖陽(yáng)黃酮具有抗氧化[7]、延緩衰老[8]、清除自由基及抗癌[9]等多種藥理活性。研究表明，鎖陽(yáng)提取物具有防治AD的潛能[10-11]。本研究觀察鎖陽(yáng)黃酮對(duì)AD大鼠海馬組織ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表達(dá)的影響，為AD防治提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠70只，4月齡，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2020-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（甘）2020-0006。飼養(yǎng)于甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（20±2）℃，濕度35%～55%，12 h光照/黑暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物及制備

鎖陽(yáng)，2021年3月采集于內(nèi)蒙古，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為鎖陽(yáng)Cynomorium songaricumRupr.的干燥肉質(zhì)莖。將新鮮鎖陽(yáng)晾至完全干透，粉碎，過2號(hào)篩，60 ℃烘干，加12倍量65%乙醇，80 ℃回流提取2 h，趁熱過濾，濾液濃縮至無(wú)醇味，用HPD-826型大孔吸附樹脂對(duì)提取物進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，將洗脫液濃縮，真空干燥，得到純化后的鎖陽(yáng)黃酮（純度88.86%），用生理鹽水分別配制成濃度為 2.5、5、10 mg/mL 溶液。Aβ1-42（批號(hào)04010011827），強(qiáng)耀生物科技有限公司，將1 mg Aβ1-42凍干粉溶于50 μL DMSO中，加水至200 μL，稀釋成5 μg/μL，分裝，避光貯存于-80 ℃冰箱備用。鹽酸多奈哌齊（批號(hào)2010023），衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，用生理鹽水配制成0.05 mg/mL水溶液。

1.3 主要試劑與儀器

DAB試劑盒（貨號(hào)ZLI-9018），北京中杉金橋；ROS試劑盒（貨號(hào)ZC-36726），上海茁彩；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)P0009），上海碧云天；Aβ1-42抗體（貨號(hào)25524-1-AP），武漢三鷹；gp91phox抗體（貨號(hào)A1636）、p47phox抗體（貨號(hào)A1148）、p67phox抗體（貨號(hào)A3703）、NLRP3抗體（貨號(hào)A5652）、β-actin抗體（貨號(hào)AC026），武漢愛博泰克；白細(xì)胞介素（IL）-1β抗體（貨號(hào)bs-0812r）、p22phox抗體（貨號(hào)bs-3879r），北京博奧森。大鼠腦立體定位儀（型號(hào)WT-200）、Morris水迷宮（型號(hào)MT-200），成都泰盟；數(shù)字切片掃描儀（型號(hào)Pannoramic 250），匈牙利3DHIESTECH公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)SpectraMAX Plus384），上海美谷；化學(xué)發(fā)光成像儀（型號(hào)5200），上海天能科技；RT-PCR儀（型號(hào)QuantStudioTM3），美國(guó)賽默飛。

1.4 造模

70只大鼠隨機(jī)選取10只作為空白組、10只作為假手術(shù)組，剩余50只大鼠進(jìn)行造模。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉大鼠，頭部備皮，縱行切口，暴露前囟門，參照腦立體定位坐標(biāo)[12]確定海馬位置（前囟后沿中線移3.0 mm，左右各旁開2.2 mm，硬腦膜下深3 mm），用牙科鉆在顱骨上鉆孔（直徑約1 mm），用微量進(jìn)樣器在雙側(cè)海馬分別注射Aβ1-42溶液1 μL，留針5 min，緩慢退針。于傷口處撒適量青霉素，縫合皮膚，碘伏消毒，單籠飼養(yǎng)?？瞻捉M不予任何處理，假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。

1.5 分組及給藥

將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、多奈哌齊組及鎖陽(yáng)黃酮低、中、高劑量組，每組10只。術(shù)后3 d開始給藥，多奈哌齊組予多奈哌齊溶液0.5 mg/kg灌胃，鎖陽(yáng)黃酮低、中、高劑量組分別予鎖陽(yáng)黃酮溶液25、50、100 mg/kg灌胃，體積1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)28 d?？瞻捉M、假手術(shù)組及模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.6 行為學(xué)檢測(cè)

從給藥第21天開始，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[13]評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。包括定位航行（21～25 d）和空間探索（26 d）兩部分，分別記錄大鼠末次60 s內(nèi)逃避潛伏期、跨平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.7 取材

末次行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，靜置2 h，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存，用于ELISA檢測(cè)。取血后脫頸處死大鼠，3只取全腦于4%多聚甲醛中固定，用于HE及免疫組化染色；剩余大鼠冰上迅速取腦并分離雙側(cè)海馬組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于ELISA、Western blot及RT-PCR檢測(cè)。

1.8 HE染色

固定的腦組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水后，石蠟包埋，切片，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.9 免疫組化染色

腦組織經(jīng)固定、脫水、包埋、切片后，進(jìn)行抗原修復(fù)、血清封閉，滴加Aβ1-42一抗（1∶50），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，常溫孵育1 h，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，以黃色或棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，使用Halo數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計(jì)算每張圖像陽(yáng)性面積占比。

1.10 ELISA檢測(cè)

取海馬組織及血清，海馬組織按質(zhì)量/體積比1∶9加入PBS，使用組織研磨儀進(jìn)行勻漿，勻漿液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定海馬組織及血清ROS含量。

1.11 Western blot檢測(cè)

取海馬組織，加入3 mm鋼珠及RIPA裂解液，置于-20 ℃高速低溫組織研磨儀內(nèi)研磨4次，每次60 s，4 ℃冰箱裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按4∶1比例加入5×loading buffer，混勻后熱循環(huán)儀95 ℃、15 min進(jìn)行蛋白變性。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、IL-1β、NLRP3 一抗（1∶2 000）和β-actin一抗（1∶100 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育2～3 h。超敏ECL曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.12 RT-PCR檢測(cè)

TRIzol法提取海馬組織總RNA，測(cè)定RNA濃度，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。配制PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸，采集熒光30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)量。引物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用方差分析，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠行為學(xué)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01），跨平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、跨平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.05，P<0.01），鎖陽(yáng)黃酮低劑量組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.05），鎖陽(yáng)黃酮中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.01），鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01）、跨平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽(yáng)黃酮低劑量組鎖陽(yáng)黃酮中劑量組鎖陽(yáng)黃酮高劑量組只數(shù)10 10 10 10 10 10 10逃避潛伏期/s 16.42±3.42 17.69±6.04 37.37±4.76**20.17±4.81&&34.54±7.82 25.12±4.12&&19.52±4.54&&跨平臺(tái)次數(shù)4.9±2.02 5.6±2.07 1.8±1.23**3.8±1.81&2.6±1.58 3.1±1.73 3.7±2.00&目標(biāo)象限停留時(shí)間/s 28.07±7.01 33.01±9.44 10.59±3.48**25.13±8.77&&18.20±8.28&21.75±5.83&&22.88±7.58&&

2.2 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠海馬組織病理形態(tài)的影響

空白組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列正常，未見明顯細(xì)胞壞死、膠質(zhì)細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)染色加深，胞核邊界不清晰，局部錐體細(xì)胞排列紊亂；與模型組比較，多奈哌齊組及鎖陽(yáng)黃酮中、高劑量組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較正常，凋亡等病理形態(tài)有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.3 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠海馬組織β淀粉樣蛋白1-42表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)比較（±s，%）

表3 各組大鼠海馬組織Aβ1-42表達(dá)比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，&P<0.05

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽(yáng)黃酮低劑量組鎖陽(yáng)黃酮中劑量組鎖陽(yáng)黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3陽(yáng)性面積比0.21±0.05 0.32±0.01 11.72±1.34*3.44±0.79&8.93±1.81 6.97±0.63 5.14±0.54&

圖2 各組大鼠海馬組織Aβ1-42陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，標(biāo)尺=100 μm）

2.4 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠海馬組織和血清活性氧含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織和血清ROS含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠海馬組織和血清ROS含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織和血清ROS含量比較（±s，U/mL）

表4 各組大鼠海馬組織和血清ROS含量比較（±s，U/mL）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽(yáng)黃酮低劑量組鎖陽(yáng)黃酮中劑量組鎖陽(yáng)黃酮高劑量組海馬組織只數(shù)6 6 6 6 6 6 6 ROS 17.09±3.87 15.74±6.03 33.30±7.62**23.35±5.49&&35.49±3.36 35.77±3.64 26.65±5.19&&血清只數(shù)10 10 10 10 10 10 10 ROS 20.40±2.82 20.06±6.44 37.37±7.25**22.88±8.22&31.11±4.93 29.34±7.15 26.19±4.17&&

2.5 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和Nod樣受體蛋白3、白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)升高（P<0.01）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基和NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽(yáng)黃酮低劑量組鎖陽(yáng)黃酮中劑量組鎖陽(yáng)黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.00 1.03±0.21 8.71±0.96**2.16±0.46&&4.59±0.56&&2.93±0.29&&2.11±0.26&&p22phox 1.00±0.00 0.93±0.06 5.72±0.91**2.31±0.32&&4.01±0.14&&3.66±0.08&&2.22±0.33&&p47phox 1.00±0.00 1.08±0.11 3.29±0.18**1.44±0.18&&2.64±0.39&&2.01±0.26&&1.47±0.10&&p67phox 1.00±0.00 0.99±0.03 3.99±0.21**1.63±0.16&&3.09±0.51 2.60±0.51 1.65±0.15&&NLRP3 1.00±0.00 1.00±0.03 8.26±0.48**1.92±0.28&&6.45±0.46 3.25±0.32&&1.89±0.03&&IL-1β 1.00±0.00 1.06±0.10 4.29±0.30**2.06±0.02&3.67±0.42 2.85±0.21&2.09±0.05&

2.6 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)模型大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，多奈哌齊組和鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.05）。見表6。

表6 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠海馬組織NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，&P<0.05，&&P<0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組多奈哌齊組鎖陽(yáng)黃酮低劑量組鎖陽(yáng)黃酮中劑量組鎖陽(yáng)黃酮高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 gp91phox 1.00±0.04 0.83±0.09 13.01±1.78*2.28±0.16&9.62±0.21 4.90±0.21 2.31±0.06&p22phox 1.00±0.10 1.00±0.07 2.42±0.19**1.31±0.03&&1.96±0.17&&1.61±0.11&&1.49±0.07&&p47phox 1.02±0.25 0.38±0.03 12.15±0.78**2.00±0.13&&6.72±0.26&3.72±0.25&&2.39±0.10&&p67phox 1.00±0.04 0.60±0.10 9.46±0.67**1.73±0.15&&7.04±0.48 3.30±0.06&1.88±0.21&&

3 討論

目前AD臨床治療包括心理、環(huán)境及藥物干預(yù)等手段，臨床效果有待進(jìn)一步提高。中藥及其有效部位能通過多通路、多靶點(diǎn)保護(hù)神經(jīng)功能，療效及安全性較好，如人參皂苷[14]、刺參多糖[15]、紅景天苷[16]等是近年來(lái)AD防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)化合物。

氧化損傷和炎癥反應(yīng)是AD的關(guān)鍵致病因素。NADPH氧化酶與ROS生成密切相關(guān)，Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用后可激活NADPH氧化酶，繼而產(chǎn)生大量ROS，提示Aβ介導(dǎo)的NADPH氧化酶-ROS途徑在AD過程中發(fā)揮重要作用。NADPH氧化酶活性主要通過膜亞基gp91phox、p22phox和胞漿亞基p47phox、p67phox表達(dá)量來(lái)反映，其中p47phox和p67phox在各種刺激引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起始動(dòng)性及樞紐性作用，而gp91phox和p22phox亞基是NADPH氧化酶蛋白家族的關(guān)鍵成員。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織NADPH氧化酶亞基gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox蛋白和mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，而經(jīng)多奈哌齊和高劑量鎖陽(yáng)黃酮干預(yù)后，NADPH氧化酶各亞基蛋白和mRNA表達(dá)均明顯降低，提示多奈哌齊和鎖陽(yáng)黃酮可通過抑制NADPH氧化酶各亞基表達(dá)降低ROS水平。目前，關(guān)于ROS介導(dǎo)NLRP3炎性小體活化的觀點(diǎn)逐漸被認(rèn)可[17]。研究顯示，ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸可顯著降低癡呆大鼠海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白水平[18]，表明ROS產(chǎn)生是促進(jìn)NLRP3炎性小體激活的重要機(jī)制。本研究中，模型組大鼠海馬組織和血清ROS含量均明顯增加、海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高，鎖陽(yáng)黃酮高劑量組大鼠海馬組織及血清ROS含量明顯減少、海馬組織NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低，提示其能通過抑制ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NLRP3和IL-1β表達(dá)。

綜上，鎖陽(yáng)黃酮可改善AD大鼠海馬組織病理形態(tài)，下調(diào)ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表達(dá)，降低Aβ毒性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。