犢牛腹瀉隱孢子蟲病診斷技術(shù)分析

胡書梅，薛永康，劉文思，李陽光，趙玉璽，何文章，張 震

（1.河南花花牛畜牧科技有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；2.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定有限公司，鄭州 450002；3.河南省種業(yè)發(fā)展中心，鄭州 450002）

犢牛腹瀉又稱犢牛拉稀，是胃腸道的消耗性疾?。?］。該病可引起犢牛生長緩慢、生產(chǎn)性能下降，甚至死亡，治療費(fèi)用高，治愈率低，導(dǎo)致牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益損失嚴(yán)重［2］。引起腹瀉的原因較復(fù)雜，隱孢子蟲是主要的病原，有較高的檢出率［3］。隱孢子蟲病也是人畜共患病，對(duì)生物安全造成了較大的威脅［4，5］。眾多學(xué)者已在隱孢子的方法建立和亞型分析方面作出了較大的貢獻(xiàn)。

1 犢牛腹瀉隱孢子蟲病發(fā)生情況

1.1 病原學(xué)

隱孢子蟲病（Cryptosporidiosis）是由隱孢子蟲感染引發(fā)的水樣腹瀉寄生蟲病，蟲體寄生在動(dòng)物呼吸道黏膜或胃腸道上皮細(xì)胞［6，7］，是導(dǎo)致奶牛和免疫缺陷病人腹瀉的常見病原［8］。據(jù)報(bào)道，隱孢子蟲的10 多個(gè)基因型和蟲種有感染人類的風(fēng)險(xiǎn)，其中微型隱孢子蟲常在人或動(dòng)物腸道中被檢出［6］。

隱孢子蟲病流行于世界各地，由隱孢子蟲感染家畜而導(dǎo)致的損失不可估量，尤其是犢牛感染后可引起嚴(yán)重腹瀉、體型消瘦甚至影響后續(xù)生產(chǎn)性能，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

1.2 流行情況

隱孢子蟲不分季節(jié)發(fā)病，但是溫暖潮濕環(huán)境更適合其生存［8］。全世界100 多個(gè)國家或地區(qū)（包括中南美洲、大洋洲、北美洲、歐洲、亞洲和非洲等）均有隱孢子蟲病的報(bào)道［9，10］。隱孢子蟲病在中國也普遍存在，且不同月齡的犢牛感染率不同，一般情況下牛隱孢子蟲感染率隨著年齡增長而降低，病癥也會(huì)減弱，不同品種的感染率也不相同。

1.3 發(fā)病機(jī)理和臨床癥狀

細(xì)胞骨架異常是微小隱孢子蟲感染胃腸上皮細(xì)胞后的改變，導(dǎo)致柱狀上皮細(xì)胞和絨毛膜的萎縮，腸道功能受損，引起腹瀉［11，12］。部分犢牛感染隱孢子蟲后不表現(xiàn)出癥狀，部分表現(xiàn)為嚴(yán)重食欲下降、腹瀉、脫水等癥狀，但不能與其他病原導(dǎo)致的腹瀉區(qū)分開。營養(yǎng)性腹瀉也有明顯的消瘦癥狀，易誤診。戶外飼養(yǎng)的比室內(nèi)飼養(yǎng)消耗多，易引起營養(yǎng)不良、身體消瘦等癥狀［13］。

1.4 傳染源傳播途徑

隱孢子蟲病可依靠多種路徑傳播，最主要的傳播方式是糞口傳播［14］。犢牛感染后，在5～28 d 不斷外排隱孢子蟲卵，造成周邊環(huán)境污染，包括空氣、飼料和水源［15］。健康牛通過接觸攜帶蟲卵的糞便、被污染的飼料和環(huán)境導(dǎo)致隱孢子蟲擴(kuò)散?；疾∨Ｊ请[孢子蟲病主要的傳染源［16］。人類隱孢子蟲病也可通過被污染的水源和患病動(dòng)物進(jìn)行傳播［15］。

2 隱孢子蟲病常見的診斷方法

隱孢子蟲病的檢測方法較多，分別從傳統(tǒng)檢測方法和新開發(fā)的檢測方法入手，介紹隱孢子蟲病的常見實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

2.1 糞便學(xué)

漂浮法是隱孢子蟲糞便學(xué)的主要測驗(yàn)方法。其原理主要是利用比重不同的液體，隱孢子蟲卵因比重小而集中漂浮在液體表面，通過離心可收集大量的原蟲蟲卵。常用的方法如表1 所示。與其他2 種方法相比，蔗糖離心浮聚法檢出率和回收率相對(duì)較高，但由于蔗糖溶液黏性大，導(dǎo)致卵囊與雜質(zhì)的分離程度低，限制了卵囊的純度［17］。常見隱孢子蟲種的卵囊指數(shù)見表2。

表1 常用的富集蟲卵方法及比重

光學(xué)顯微鏡油鏡下檢查，經(jīng)染色的卵囊排列雜亂無章。在整個(gè)藍(lán)綠色的視野中，清晰可見圓形或橢圓形的玫瑰紅色蟲卵囊，直徑大小為4～6 μm；顏色深、月牙狀的是子孢子。

2.2 免疫學(xué)檢查

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在規(guī)模養(yǎng)殖場使用較成熟，是常用的免疫學(xué)診斷技術(shù)，相比其他檢測技術(shù)具有設(shè)備需求不高、批量檢測、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)［18］。因此，國內(nèi)外研究者廣泛應(yīng)用ELISA檢測犢牛腹瀉隱孢子蟲。

Brar 等［19］建立了ELISA 檢測方法，并在印度北方地區(qū)開展相關(guān)檢測，約有35%的腹瀉隱孢子蟲感染；Viring 等［20］對(duì)瑞典部分地區(qū)開展腹瀉犢牛樣本檢測，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲屬檢出率在6.1%左右。

ELISA 方法在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病檢測（包括隱孢子蟲），使用最多的是美國IDEXX 的ELISA 檢測試劑盒。由于成本較高，且特異性強(qiáng)，導(dǎo)致現(xiàn)有商品化ELISA 試劑盒大多只能檢測微小隱孢子蟲（高純度抗原制備困難），在牧場、基層實(shí)驗(yàn)室推廣緩慢。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測技術(shù)（PCR）

生物檢測技術(shù)不斷進(jìn)步，常見的常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）、巢式PCR、數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）可用于病原的檢測。

2.3.1 常規(guī)PCR 該方法是最基礎(chǔ)的PCR 方法，通過設(shè)計(jì)出特定病原保守序列的一對(duì)上下游引物，然后從樣品核酸中擴(kuò)增對(duì)應(yīng)片段，最后通過測序確定病原種屬。Gomez 等［21］設(shè)計(jì)了牛冠狀病毒特異性引物，并對(duì)樣本進(jìn)行測試。

2.3.2 巢式PCR 巢式PCR 需要針對(duì)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，因此需要進(jìn)行兩輪反應(yīng)，而且第二輪反應(yīng)將使用第一輪反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板。Silverlas等［22］建立了隱孢子蟲巢式PCR 反應(yīng)體系，不僅可以對(duì)樣本中隱孢子蟲進(jìn)行檢測，還可以進(jìn)行基因鑒定。

2.3.3 qPCR qPCR 區(qū)別于其他PCR，主要是需要設(shè)計(jì)探針。qPCR 具有靈敏度好、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢，與其他PCR 方法相比，可以避免電泳檢測，減少了核酸染料（EB）對(duì)人的傷害［23］。Cho等［24］設(shè)計(jì)出一套5 種病原（包括微小隱孢子蟲）聯(lián)檢的多重qPCR 方法，該方法與普通PCR 方法相比，檢出率在88.5%～96.8%，且特異性和敏感性都優(yōu)于普通PCR。

2.3.4 dPCR dPCR 已在分子診斷過程中廣泛應(yīng)用，是絕對(duì)定量的檢測技術(shù)。相較于qPCR，dPCR 能直觀測出DNA 分子數(shù)量。但是缺少效果好的隱孢子蟲dPCR 市售試劑盒產(chǎn)品。

與 普通PCR 和巢 式PCR 相比，qPCR 具有 準(zhǔn) 確性高、操作簡便等特點(diǎn)；與dPCR 相比，qPCR 具有價(jià)格低的優(yōu)勢。綜合考慮，在不進(jìn)行絕對(duì)定量的前提下，qPCR 可以在腹瀉病原檢測過程中作為及時(shí)有效的診斷方式。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（LAMP）

LAMP 是被很多學(xué)者應(yīng)用于病原診斷的一種新型擴(kuò)增技術(shù)，具有用時(shí)短、特異性高等特點(diǎn)，其最突出的優(yōu)勢是可以在恒溫條件下（63±3 ℃）進(jìn)行擴(kuò)增。史亞東［25］基于LAMP 技術(shù)建立了快速從糞樣中檢測微小隱孢子蟲的檢測方法，通過臨床驗(yàn)證后具有較好的特異性。LAMP 易發(fā)生非特異性擴(kuò)增和氣溶膠污染，是制約該技術(shù)在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室推廣的原因［26］。

2.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)在人遺傳缺陷病和特定病原檢測中已有使用［27，28］，該技術(shù)具有操作簡便、較高的準(zhǔn)確性、多病原同時(shí)檢測和易于推廣等優(yōu)勢，但也存在一些劣勢，比如技術(shù)成本高、重復(fù)性較差、受限于儀器設(shè)備等。有部分科研院所已在動(dòng)物疫病檢測中應(yīng)用該技術(shù)。該技術(shù)在犢牛腹瀉病原診斷中的應(yīng)用值得期待。

2.6 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）

RPA 技術(shù)是新興的擴(kuò)增技術(shù)，可能替代常規(guī)PCR 新技術(shù)。該技術(shù)最大的優(yōu)勢是可在37 ℃左右的等溫條件下完成擴(kuò)增，且擴(kuò)增過程10～20 min 就能完成，降低了核酸擴(kuò)增對(duì)儀器設(shè)備的條件限制，適合用于實(shí)驗(yàn)室診斷和現(xiàn)場診斷。RPA 已在金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、衣原體等病原檢測方面廣泛運(yùn)用，但是還未在犢牛腹瀉病原檢測領(lǐng)域應(yīng)用。

3 討論

犢牛腹瀉病病原復(fù)雜，存在單獨(dú)感染和多病原混合感染，癥狀較為相似，臨床上很容易造成誤診，病牛常因?yàn)榈貌坏郊皶r(shí)診斷和有效的治療，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。微小隱孢子蟲既是牛腹瀉重要病原，也是隱藏的人畜共患病病原，免疫力低的人員（老人和兒童等）與攜帶病原犢牛接觸后，有一定感染風(fēng)險(xiǎn)，因此針對(duì)隱孢子蟲的早期鑒別診斷對(duì)犢牛腹瀉的防治較為重要。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的先進(jìn)技術(shù)將被應(yīng)用到動(dòng)物疫病檢測，希望隱孢子蟲檢測手段日趨改進(jìn)，為隱孢子蟲病的診斷提供支撐。