高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定三七中胺苯磺隆殘留量的不確定度分析

王 英，吳思超，李云飛，呂 平，尤 娜，胡湘玲，程 龍，陳庚超

（1.昆明海關(guān)技術(shù)中心，昆明 650228；2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，東莞 523071；3.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200335）

三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，同時也是保健食品，具有活血化瘀［1，2］、抗炎［3］、抗腫瘤［4］、抗血栓［5］、降血脂［6，7］、增強免疫力［8］等功效。為了提高三七的產(chǎn)量，除去三七生長環(huán)境周圍的雜草，藥農(nóng)通常會使用除草劑胺苯磺?。‥thametsulfuron）防治雜草危害，導致三七藥材中的胺苯磺隆殘留對人類健康安全造成威脅。胺苯磺隆，又名油磺隆、菜王星，CAS 號為97780-06-8，分子式為C15H18N6O6S，是由美國杜邦公司20世紀80 年代開發(fā)的磺酰脲類長效除草劑，其作用機理是抑制支鏈氨基酸合成中乙酰乳酸合成酶的活性［9］。胺苯磺隆對多種雜草都具有用量低、防效高、殺草譜廣、使用成本低等優(yōu)點，深受廣大用戶歡迎［10］。胺苯磺隆檢測方法包括超高效液相色譜法-串 聯(lián) 質(zhì) 譜（HPLC-MS/MS）法［11］、高 效 液 相 色 譜法［12］、分子印跡技術(shù)［13］等。

已有報道鮮見三七中胺苯磺隆殘留量不確定度評定，本研究分別依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》［14］和JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》［15］，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對三七中胺苯磺隆殘留量的不確定性進行評價，評估各組分的不確定度貢獻值，對標準不確定度和擴展不確定度進行計算，為保障檢測數(shù)據(jù)的準確性，促進三七出口貿(mào)易提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

三七，云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團）股份有限公司；胺苯磺?。兌?8.5%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），德國Merck 公司；乙酸銨（色譜級），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸、氯化鈉（分析純），西隴科學股份有限公司；QuEChERS 方法提取包（無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末，4∶1）、QuEChERS 中藥農(nóng)殘凈化管（無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、石墨化碳黑90 mg），日本島津公司。

1.2 儀器與設備

4500 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ABSCIEX 公司）；XS205DU 型分析天平（瑞士Mettler 公司）；Milli-Q 型純水系統(tǒng)（電導率為18.2 M?，美國Millipore 公司）；渦旋振蕩器（中國Wiggens 公司）；3K15 型高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

1）色譜方法。Hypersil GOLD C18 色譜柱（100 mm×2.1 nm，1.8 μm）；液相流動相流速設為0.3 mL/min；柱溫箱溫度設為40 ℃；進樣體積為10 μL；液相流動相A 為2 mmol/L 乙酸銨水溶液，流動相B 為乙腈；具體流動相洗脫方法見表1。

表1 流動相洗脫方法

2）質(zhì)譜方法。ESI 正離子掃描；多反應監(jiān)測模式（MRM）；駐留時間：50 ms；離子源溫度：500 ℃；霧化器壓力：35 psi；電噴霧電壓：4 500 V；離子對（m/z）：294.1/170.1（定性離子）、294.1/137.1（定量離子）；錐孔電壓：120 V；碰撞電壓：24、13 V。

1.3.2 標準溶液的配制 準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）胺苯磺隆標準品，用乙腈溶解并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的胺苯磺隆儲備液；用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的外標中間液，避光保存于4 ℃冰箱中。

工作溶液：從質(zhì)量濃度1 μg/mL 的外標中間液中分別準確吸取5、10、25、50、100 μL，用乙腈稀釋配制成胺苯磺隆工作液，最終質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100 ng/mL。

1.3.3 樣品前處理 稱取粉碎后過3 號篩（50 目）的三七粉末3 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL 離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋振蕩1 min，放置30 min，準確加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500 r/min）10 min，加入QuEChERS 方法提取包，立即搖散，再置于振蕩器上劇烈振蕩（500 次/min）10 min，離心（4 000 r/min）5 min，取上清液2 mL 放入QuEChERS 中藥農(nóng)殘凈化管中，渦旋1 min，離心（4 000 r/min）5 min，取上清液過濾，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標標準曲線法計算。

1.4 數(shù)學模型

式中，X為三七中的胺苯磺隆殘留量（mg/kg）；c為樣液中胺苯磺隆的質(zhì)量濃度（mg/L）；v為三七樣品的最終定容體積（mL）；f為樣品前處理稀釋倍數(shù)；m為三七樣品稱樣量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度主要來源

通過對樣品中胺苯磺隆殘留量檢測過程進行分析，發(fā)現(xiàn)引入不確定度的主要來源包括：①標準品溶液配置；②試樣稱重；③樣品測定過程中，由重復性引入；④高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入；⑤標準曲線線性擬合產(chǎn)生；⑥添加回收引入的不確定度［16］。

2.2 各分量不確定度的評定

2.2.1 標準品溶液配制引起的相對不確定度Urel（C）

1）由標準品純度引起的不確定度［17］。本試驗使用的胺苯磺隆標準物質(zhì)購于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，其證書顯示純度為98.5%，擴展不確定度為1.2%（k=2），因此，胺苯磺隆標準品的相對標準不確定度為

2）標準物質(zhì)稱量引起的不確定度。使用十萬分之一天平精密稱取胺苯磺隆對照品10 mg（精確至0.01 mg）。由該分析天平的校準證書可知，該天平的允許誤差為±0.5 mg，服從均勻分布，取包含因子

3）標準溶液配制過程中產(chǎn)生的不確定度Urel（C3）。依據(jù)JJG 646—2006《移液器》［18］、JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［19］，不確定度計算采用最大允許誤差，按均勻分布，包含因子k= 3，對不確定度開展評價［20］，結(jié)果見表2。

表2 標準溶液配制過程引入的不確定度

在本次標準溶液配制過程中由移液器和容量瓶帶來的不確定度合成為［16］：Urel（C3）=0.004 85。

綜合以上3 個不確定度分量，標準品溶液配制引入的相對合成不確定度為Urel（C）=

2.2.2 樣品稱量引入的相對不確定度Urel（m）樣品的稱樣量為3 g 試樣（精確至0.01 g）。稱量引入的不確定度，按照天平校準證書，天平的最大允許誤差計算得到對不確定度為

2.2.3 試樣測量重復性引入的相對不確定度Urel(Sˉ)對相同樣品6 份，按照相同前處理操作后在相同液相色譜質(zhì)譜條件下進行檢測，樣品中胺苯磺隆含量重復性測定結(jié)果見表3。

表3 試樣測量重復性結(jié)果

計算得到標準偏差為0.216 41%，平均含量為50.424 2 μg/kg。因此，重復性測定引起的相對合成不確定度為=0.000 017。

2.2.4 標準曲線產(chǎn)生的相對標準不確定度Urel（Q）對標準溶液濃度與響應值進行擬合［16］，計算得到胺苯磺隆回歸方程及相關(guān)系數(shù)，Y=5 147.033 99X+79.368 20，相關(guān)系數(shù)r=0.995 33，其中截距a=79.368 20，斜率b=5 147.033 99，供試品溶液濃度平均值為50.424 2 μg/kg，計算標準曲線的殘差標準偏差SR為：

式（2）中，SR為擬合標準偏差，a為曲線截距，b為曲線斜率，ci為第i次根據(jù)標準曲線計算得到的濃度；n為標準溶液的總測量次數(shù)，每個標準點測3 次，n=15；yi為第i次測得的色譜峰面積［21］。根據(jù)計算得到胺苯磺隆的標準偏差SR=639 260.25。

曲線擬合標準不確定度（UQ）計算公式為［16］：其 中SR為標準曲線的標準差；p為樣品平行測定次數(shù)，p=6；b為曲線斜率；n=15；c為樣品溶液中胺苯磺隆的濃度為胺苯磺隆的平均濃度，ci為第i次根據(jù)標準曲線計算得到的胺苯磺隆濃度。因此，

2.2.5 添加回收引入的不確定度Urel（R）取6 份空白三七樣品，分別加入0.05 mg/kg 的胺苯磺隆標準溶液，進行加標回收試驗［16］，試驗結(jié)果見表4。計算得到標準偏差為3.66%，平均回收率為88.2%，

表4 試樣加標回收結(jié)果（n=6）

2.3 相對合成標準不確定度

分別將各不確定度分量進行合成［16］，得到：Urel0.034 3。樣品中胺苯磺隆平均含量為50.424 2 μg/kg，則 其 標 準 不 確 定 度 為U（X）=0.034 3×50.424 2=1.729 6 μg/kg。

2.4 擴展不確定度評定

擴展不確定度由合成標準不確定度乘以包含因子，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，則胺苯磺隆測量結(jié)果的相對擴展不確定度為U=U（X）×k=1.729 6×2=3.459 2 μg/kg。胺苯磺隆含量X=（50.424 2±3.459 2）μg/kg，k=2。

3 小結(jié)

本研究分析了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定三七中胺苯磺隆殘留量的不確定度，通過計算給出了胺苯磺隆相對合成標準不確定度及擴展不確定度。由評定結(jié)果可知，測量結(jié)果的不確定度主要由標準溶液配制所引入，添加回收所引入的不確定度次之，其余各成分所引入的不確定度影響較低。因此，應對日常檢測工作中的設備儀器定期進行檢定校準，嚴格遵循標準檢驗規(guī)程，以提升檢驗水平和員工的檢測能力，來減小測量不確定度，從而保障檢測結(jié)果的準確性。