高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞蛋中多西環(huán)素藥物殘留

張 美，朱莉莎，徐飄飄，曾 婧，向文婷，歐亞紅，梁繼翔，彭大鵬

（1.武漢工控檢驗檢測有限公司，武漢 430030；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類價格低廉、抗菌活性高的廣譜抗菌素，包含四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素（Doxycycline）、強力霉素、脫氧土霉素等［1］。其中，多西環(huán)素廣譜高效且價格低廉，是蛋雞養(yǎng)殖中使用較多的四環(huán)素類藥物，主要用于大腸桿菌病、沙門氏菌病、慢性呼吸道疾病等疾病的防治［2，3］。為保障食品安全，2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部聯(lián)合國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布了食品中獸藥最大殘留限量的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了四環(huán)素類在家禽的肝、腎、皮膚和肌肉的最大殘留限量分別為300、600、300、100 μg/kg，蛋雞產(chǎn)蛋期禁止使用相關(guān)藥物［4］。

雞蛋營養(yǎng)豐富且價格低廉，是人類重要的動物源性食品［1］。在蛋雞的飼養(yǎng)過程中部分養(yǎng)殖戶在經(jīng)濟利益的驅(qū)動下沒有規(guī)范使用獸藥、飼料和墊料等，雞蛋中藥物殘留超標(biāo)的事件時有發(fā)生，造成食品安全隱患［5］。楊歡春等［6］研究報道，2016—2017 年寧夏回族自治區(qū)市售雞蛋和雞肉樣品抽檢中均發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素藥物類抗生素殘留超標(biāo)。孫言鳳等［7］研究發(fā)現(xiàn)，2016—2018 年湖北省抽檢的538 份雞肉和雞蛋樣品中多西環(huán)素殘留超標(biāo)率達(dá)12.8%。2012 年歐盟多國獸藥殘留監(jiān)測均發(fā)現(xiàn)有多西環(huán)素殘留超標(biāo)的現(xiàn)象［8］。

國內(nèi)外報道了多種用于檢測動物源性食品中多西環(huán)素殘留的檢測方法，如高效液相色譜法［9-11］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法［12，13］。此類檢測方法多集中于豬肉、雞肉、魚肉等動物可食性組織［14］。本研究以食品安全關(guān)注度高的雞蛋為材料，探究建立了一種檢測雞蛋中多西環(huán)素藥物殘留的靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作便捷的HPLC-MS/MS檢測方法，為快速、靈敏地檢測雞蛋中多西環(huán)素藥物的殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、NaOH、NaH2PO4、檸檬酸和草酸均購自中國醫(yī)藥集團有限公司；多西環(huán)素（DOTC）標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞蛋市售；去離子水。試驗于2018年11月至2019年5月進(jìn)行。

1.2 主要儀器

SHIM AD ZU20A 型高效液相色譜儀，日本島津公司；HH 型恒溫水浴鍋，湖北琴臺醫(yī)療器械廠；TGL-16B 型冷凍高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；N-EVAPTM111 型氮吹儀，美國路易公司；CPA225D 型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；API5000 型三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Applied Biosystems 公司；WX-80A 型旋渦混合器，北京六一儀器廠；KQ3200 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試劑配制

1.3.1 Na2HPO4溶液的配制 準(zhǔn)確稱取Na2HPO471.63 g，加去離子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.2 mol/L Na2HPO4溶液。

1.3.2 0.1 mol/L 檸檬酸溶液配制 準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.01 g，加去離子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.1 mol/L 檸檬酸溶液。

1.3.3 Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液 取625 mL的0.2 mol/L Na2HPO4溶液加入1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液中，混合均勻，用稀HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH至4.0±0.05；準(zhǔn)確稱取60.50 g Na2-EDTA 加入其中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙狻?/p>

1.3.4 多西環(huán)素儲備液 用甲醇將多西環(huán)素配成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存，有效期為2 個月。

1.4 樣品制備

取適量的新鮮雞蛋去殼，混勻后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1 提取 準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的雞蛋樣品1.00 g 置于10 mL 離心管中，加入1.5 mL Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，渦旋1 min，再加入4.5 mL 乙腈溶液，振蕩10 min；室溫條件下超聲振蕩15 min，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液于新的10 mL離心管中，得到空白基質(zhì)溶液。

1.4.2 凈化 選擇相應(yīng)的固相萃取柱無需活化，取“1.4.1”制備的上清液3 mL 過柱，收集濾液于10 mL離心管中，40 ℃水浴條件下氮氣吹干，再用初始比例的流動相溶液作為復(fù)溶液0.5 mL 溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取過濾液待后續(xù)試驗。

取6 份空白雞蛋樣品，經(jīng)提取純化后，加入適量的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制成濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg 和10.0 μg/kg 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機檢測，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity Uplc BEH C18（2.1 mm ×50 mm，2.5 μm），固相萃取柱為waters prime HLB 200 mg/6 mL，濾膜為0.22 μm，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL；流動相A 相：0.1%甲酸水溶液；B 相：乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 多西環(huán)素梯度洗脫條件

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）模式：正離子電離模式（ESI+）掃描，多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，離子源溫度250 ℃，霧化氣流速3.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min，加熱模塊溫度400 °C，干燥氣流速10.0 L/min，氬氣17.0 kPa，其他多西環(huán)素質(zhì)譜參數(shù)如表2 所示。

表2 多西環(huán)素質(zhì)譜參數(shù)

1.7 線性范圍的確定

分別用甲醇和空白基質(zhì)溶液稀釋多西環(huán)素儲備液，得到多西環(huán)素濃度為10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)工作液，待上機檢測。

1.8 準(zhǔn)確度與精密度

在空白基質(zhì)溶液中加入多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別制備多西環(huán)素濃度為10.0、3.0 μg/kg和1.0 μg/kg的添加樣品，按上述處理步驟進(jìn)行殘留測定。將測定濃度與藥物理論添加濃度進(jìn)行比較，得到藥物添加回收率，每個添加水平平行測定6 次，得到其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。以回收率表示方法的準(zhǔn)確度，相對偏差表示精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍的確定

標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和雞蛋基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y= 137 782x+152 808 和y= 135 699x+150 714（圖1）。二者線性范圍均在0.5～10.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.990 0?？梢姌悠坊|(zhì)影響較小，可以直接通過標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線計算回收率。

圖1 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線與雞蛋基質(zhì)匹配曲線

2.2 檢測限與定量限

空白基質(zhì)溶液中添加藥物后經(jīng)試驗得到特征離子色譜信噪比，本方法實際檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

在3 個加標(biāo)水平上，多西環(huán)素的平均回收率為85.4%～93.1%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15%（表3）。結(jié)果表明，本方法回收率較高，重復(fù)性好。

表3 多西環(huán)素在雞蛋樣品中的回收率

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

不同的色譜柱對藥物的保留時間會有不同，預(yù)試驗對已經(jīng)報道的Waters Acquity Uplc BEH C18［15］和Hypersll GOLD C18［16］色譜柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Waters Acquity Uplc BEH C18 對多西環(huán)素的分離度更好，響應(yīng)值更高。因此，本研究選擇Waters Acquity Uplc BEH C18 色譜柱。

3.2 流動相的選擇

流動相體系會影響樣品分離的效果。參考文獻(xiàn)［17-19］，預(yù)試驗分別比較了磷酸-甲醇、甲酸-甲醇、三氟乙酸-甲醇、磷酸-乙腈、甲酸-乙腈和三氟乙酸-乙腈這6 種不同流動相體系。結(jié)果表明，甲酸-乙腈為流動相時梯度洗脫效果最佳，能夠很好地解決色譜峰拖尾現(xiàn)象，保留時間良好，柱壓也較低。因此，本研究選擇甲酸水-乙腈作為流動相，同時在最初的梯度中保持較高的水相比例，使目標(biāo)物得以充分保留。

3.3 提取試劑的選擇

四環(huán)素類藥物屬于酸堿兩性物質(zhì)［20］，其在弱酸性溶液中較為穩(wěn)定，在堿性、中性或強酸性溶液中均易與金屬離子、蛋白質(zhì)絡(luò)合［11］。卜曉娜等［14］研究表明，Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖液為弱酸性溶液，提取四環(huán)素類藥物效果較好。此外，還有采用按比例混合的甲醇乙酸水［21］、0.01 mol/L Na2-EDTA 溶液和0.3%磷酸溶液［22］等作為提取液的報道。由于雞蛋中富含蛋白質(zhì)及磷脂，故本研究采用乙腈和Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖液作為提取液，當(dāng)有機相比例達(dá)80%時，達(dá)到了最佳提取效果。

3.4 凈化條件的優(yōu)化

因動物組織中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，為了避免對色譜儀器的損害以及減少雜質(zhì)的干擾，通常需要對目標(biāo)分析物進(jìn)行凈化。預(yù)試驗比較了MAX、HLB、prime HLB、C18 和液液萃取的凈化效果［11，18，23］。結(jié)果表明，液液萃取處理方法相對簡單，但樣品回收率不穩(wěn)定、回收率低，不能滿足要求。本研究選用Waters prime HLB 固相萃取柱，無需活化，提取凈化方便，回收率及穩(wěn)定較高，可以滿足本試驗要求。

4 小結(jié)

本研究成功建立了雞蛋中多西環(huán)素藥物殘留檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。本方法樣品前處理簡單，檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg；準(zhǔn)確度好，回收率為85.4%～93.1%；精密度高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%～13.5%，可以滿足雞蛋中多西環(huán)素殘留檢測的要求。