復(fù)方牛至油納米乳液制備及其對(duì)奶牛乳房炎四種病原菌的體外抗菌試驗(yàn)

張文娟，朱小甫，尹寶英，熊忙利

（咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院∕咸陽(yáng)市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712000）

奶牛乳房炎是奶牛的三大重要疾病之一，全球每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億美元。奶牛乳房炎是由機(jī)械性刺激、病原微生物侵襲、化學(xué)物理性損傷所引起的炎癥，分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎2 種類型［1］。該病導(dǎo)致奶牛的產(chǎn)奶量急劇下降，甚至失去產(chǎn)奶能力，同時(shí)也會(huì)造成牛奶質(zhì)量下降，其發(fā)病率為5%～45%。對(duì)奶牛乳房炎的治療，國(guó)內(nèi)外主要采用抗生素和化學(xué)合成藥物，容易造成藥物在牛奶中殘留［2］，長(zhǎng)期使用可引起奶牛乳房菌群產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性以及對(duì)公共衛(wèi)生健康造成危害等后果［3］。納米乳液是將油、水、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例混合而成的新型藥物載體，透明或半透明，低黏度，為動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定體系，粒徑在1～100 nm。納米乳液不僅制備簡(jiǎn)單，熱力學(xué)穩(wěn)定，還具有增加不溶性藥物的溶解度、提高藥物的生物利用度和提高易水解藥物的穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)［4］。本研究將中草藥提取物牛至油、丁香酚和化學(xué)藥物醋酸氯已定進(jìn)行復(fù)配，制備成復(fù)方牛至油納米乳液劑，通過(guò)對(duì)奶牛乳房炎4 種病原菌進(jìn)行體外抗菌研究，旨在為臨床提供一種低耐藥性、低殘留、使用方便、安全、高效的新型納米藥物制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌，均由咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院咸陽(yáng)市動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯，均從青島海博生物技術(shù)有限公司購(gòu)買，自制血清肉湯。

1.1.3 試驗(yàn)藥品 牛至油，濟(jì)南凱茵生物科技有限公司生產(chǎn)；丁香酚，南昌貝塔生物科技有限公司；醋酸氯乙定，錦州九泰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；蓖麻油聚氧乙烯醚（EL40）、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚（RH40），西安晉湘藥用輔料有限公司生產(chǎn)；吐溫-80、乙醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、蘇丹III 染液、亞甲基藍(lán)染液，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 儀器設(shè)備 JEM-1230 型透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司生產(chǎn)；TGL 16B 型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；ZetasizerNano ZS 型激光粒度測(cè)定儀，英國(guó)Ma|vern instrument 公司生產(chǎn)；BS-210S 型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯（sartorius）股份公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司生產(chǎn)；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方牛至油納米乳液處方優(yōu)化 油相選擇，納米乳形成過(guò)程中，油應(yīng)與表面活性劑保持進(jìn)行互相作用，易于成膜［5］。油相的鏈越短，越易滲透到膜中，而碳?xì)滏溤介L(zhǎng)的油相，則會(huì)提高藥物的溶解度。將牛至油和丁香酚按照質(zhì)量比為2∶1 的比例進(jìn)行混合作為油相。助表面活性劑選擇，助表面活性劑的加入可以調(diào)節(jié)表面活性劑的親水親油平衡值，降低油水界面張力，提高界面膜的流動(dòng)性，有利于納米乳的形成［6］。選用無(wú)水乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇作為助表面活性劑。表面活性劑的篩選及Km 確定，表面活性劑可按親水親油平衡值（HLB）來(lái)進(jìn)行篩選，HLB 在3～8 的乳化劑可制備成油包水型（W∕O）納米乳，HLB在8～16 的乳化劑可制備水包油型（O∕W）納米乳［7］。本試驗(yàn)待選表面活性劑和HLB 均大于7，分別為EL40、RH40 和吐溫-80。室溫下，將上述3種表面活性劑分別與助表面活性劑按照Km 分別為2∶1、3∶1、4∶1 混勻，再與油相分別按質(zhì)量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9 的比例混勻，攪拌后逐漸滴入蒸餾水，邊加邊攪拌，當(dāng)水加到一定量時(shí)，體系會(huì)變黏稠，此時(shí)為油包水型，繼續(xù)滴加蒸餾水，當(dāng)體系突然變得不再黏稠時(shí)，即由油包水型轉(zhuǎn)變?yōu)榱怂托停藭r(shí)納米乳液即形成。記錄轉(zhuǎn)相時(shí)添加的蒸餾水量，以表面活性劑、油和水的用量作為相圖的3 個(gè)頂點(diǎn)，利用Origin pro 7.5 軟件繪制三元相圖，并根據(jù)乳化面積大小確定最佳的表面活性劑。復(fù)方牛至油納米乳液制備，稱取6 g 牛至油、3 g 丁香酚，將其置于燒杯中混合攪拌均勻，作為油相；然后稱取27 g 吐溫-80 作為表面活性劑，再稱取9 g 乙醇作為助表面活性劑，將0.25 g 醋酸氯已定加入9 g 乙醇中，攪拌使其溶解，然后將其加入27 g 吐溫-80 中攪拌均勻，制備成混合表面活性劑；然后將油相和混合表面活性劑混合，攪拌均勻，靜置后逐滴緩慢向其中加入蒸餾水54.75 g，邊加邊攪拌，開(kāi)始時(shí)體系黏度較小，隨著水的加入，體系會(huì)變黏稠，繼續(xù)滴加并不斷攪拌，直至形成復(fù)方牛至油納米乳液。采用染色法鑒定復(fù)方牛至油納米乳液的結(jié)構(gòu)類型。將亞甲基藍(lán)和蘇丹Ⅲ染液分別滴入納米乳液中，觀察2 種染料在納米乳液中的擴(kuò)散速度，判斷其結(jié)構(gòu)類型［8］。復(fù)方牛至油納米乳液形態(tài)觀察和粒徑分布，將復(fù)方牛至油納米乳液稀釋10 倍，分為2 份。將1 份添加到涂有碳膜的銅網(wǎng)格中，2%磷鎢酸負(fù)染30 s，自然蒸發(fā)后用透射電鏡觀察了納米乳液的形態(tài)。另1 份用激光粒度分析儀測(cè)量其平均粒徑和多分散系數(shù)。牛至油納米乳的穩(wěn)定性考察，將復(fù)方牛至油納米乳液置于離心管中，10 000 r∕min 離心20 min，觀察其外觀是否清澈透明，有無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等現(xiàn)象。將3 批復(fù)方牛至油納米乳液密封于玻璃瓶?jī)?nèi)，置于（4 500±500）lx 條件下，分別于0、5、10 d 觀察其性狀有無(wú)變化，并測(cè)定乳滴粒徑大小。將3 批牛至油納米乳密封于玻璃瓶?jī)?nèi)，置于（30±2）℃、相對(duì)濕度（65±5）%條件下6 個(gè)月，分別于1、2、3、6 月取樣，觀察其性狀有無(wú)變化，并測(cè)定乳滴粒徑大小。將3批復(fù)方牛至油納米乳液密封于玻璃瓶?jī)?nèi)，置于（25±2）℃、相對(duì)濕度（60±10）%條件下12 個(gè)月，分別于0、3、6、9 月和12 月取樣，觀察其性狀有無(wú)變化，并測(cè)定乳滴粒徑大小。

1.2.2 復(fù)方牛至油納米乳液的體外抗菌試驗(yàn) 菌液制備，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌分別挑取2～3 個(gè)接種環(huán)，接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待菌種復(fù)壯后，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種至5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌分別接種至5 mL 血液瓊脂培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行6 h 的增菌培養(yǎng)。然后采用麥?zhǔn)媳葷岱ú捎脺缇睇}水將各試驗(yàn)菌稀釋到大約0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（1×108CFU∕mL），置于4 ℃下保存?zhèn)溆茫?］。打孔法，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分別薄涂各種菌懸液，后在平板中央打φ 3 mm 圓孔，在孔中加入復(fù)方牛至油納米乳液不同濃度稀釋液30 μL，然后將接種平皿均置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，每日觀察記錄結(jié)果，觀察7 d。濃度稀釋法，采用試管二倍稀釋法測(cè)定復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定。

MIC，每株菌株為1 組，共4 組，每組取10 根無(wú)菌試管，并進(jìn)行編號(hào)。分別向大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的1 至9 管中各加入2 mL 無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，向無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的1 至9 管中各加入2 mL 血清肉湯。然后分別向每組的第1 管中加入牛至油納米乳液2 mL，混勻后吸取2 mL，加第2 管混勻，依次稀釋到第8 管，從第8 管中取出2 mL 棄去，第9 管肉湯為對(duì)照組，第10 管藥液為對(duì)照組。分別向1 至9管加入試驗(yàn)菌液0.1 mL（1×108CFU∕mL），搖勻。然后將各試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，通過(guò)肉眼觀察無(wú)渾濁變化的最高藥物稀釋濃度作為MIC。

MBC，從肉眼未觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)的透明管中取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液0.01 mL 接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，提取乳酸鏈球菌和停止乳酸鏈球菌菌液0.01 mL 接種到血瓊脂平板中，置于37 °C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。如果培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)小于3，即可判定為無(wú)菌生長(zhǎng)。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最大稀釋藥物濃度作為MBC［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方牛至油納米乳液的處方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)方牛至油納米乳液的結(jié)構(gòu)類型 牛至油和丁香酚（質(zhì)量比2∶1）為油性相，蒸餾水為水相，吐溫-80 與無(wú)水乙醇在混合表面活性劑中的質(zhì)量比為3∶1，復(fù)合表面活性劑與油的質(zhì)量比為4∶1 時(shí)，亞甲基藍(lán)在納米乳液中的擴(kuò)散速度明顯快于蘇丹紅Ⅲ，說(shuō)明所制備的納米乳液為水包油型（O∕W）。

2.1.2 復(fù)方牛至油納米乳液的形態(tài)及粒徑分布 經(jīng)過(guò)透射電鏡檢測(cè)，復(fù)方牛至油納米乳液乳滴呈圓球形，乳滴分散性良好，電鏡照片見(jiàn)圖1。Z-Average為33.4 nm，PDI為0.062，其粒徑分布范圍較窄，均為10～100 nm。復(fù)方牛至油納米乳液的粒徑分布見(jiàn)圖2（數(shù)量分布）和圖3（密度分布）。

圖1 復(fù)方牛至油納米乳液的透射電鏡觀測(cè)效果

圖2 復(fù)方牛至油納米乳液的粒徑分布（數(shù)量分布）

圖3 復(fù)方牛至油納米乳液的粒徑分布（密度分布）

2.1.3 復(fù)方牛至油納米乳液的穩(wěn)定性

1）外觀。復(fù)方牛至油納米乳液為淡黃色澄明液體，外觀清澈透明，無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等。

2）高速離心試驗(yàn)。將復(fù)方牛至油納米乳液于10 000 r∕min 離心20 min 后，仍為淡黃色澄清透明的液體，外觀清澈透明，無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等現(xiàn)象，表明其穩(wěn)定性良好。

3）光照試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)過(guò)光照試驗(yàn)，復(fù)方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等現(xiàn)象。其平均粒徑隨時(shí)間變化規(guī)律見(jiàn)表1，結(jié)果表明該制劑對(duì)光照穩(wěn)定。

4）加速試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)過(guò)加速試驗(yàn)，復(fù)方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等現(xiàn)象。其平均粒徑隨時(shí)間變化規(guī)律見(jiàn)表1，結(jié)果表明該制劑在高溫和高濕環(huán)境下貯存穩(wěn)定。

5）長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期試驗(yàn)，復(fù)方牛至油納米乳液外觀清澈透明，無(wú)分層、絮凝、脫色、破乳等現(xiàn)象。其平均粒徑隨時(shí)間變化規(guī)律見(jiàn)表1，結(jié)果表明該制劑在長(zhǎng)期貯存條件下性質(zhì)穩(wěn)定。

表1 復(fù)方牛至油納米乳液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 復(fù)方牛至油納米乳液的體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 打孔法 復(fù)方牛至油納米乳液體外抗菌效果見(jiàn)表2。由表2 可知，復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)奶牛乳房炎4 種病原菌體外均有抑制作用，其對(duì)無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌抑制作用稍強(qiáng)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

表2 復(fù)方牛至油納米乳液體外抗菌效果

2.2.2 濃度稀釋法 復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌及停乳鏈球菌的MIC和MBC見(jiàn)表3。由表3 可知，復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的MIC分別為0.375、0.375、0.187、0.187 g∕mL，其MBC分別為0.750、0.750、0.375、0.375 g∕mL。結(jié)果表明，牛至油復(fù)合納米乳劑對(duì)4 種病原菌均有較好的抑制作用，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌和殺菌作用較弱，對(duì)無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的抑菌和殺菌作用較強(qiáng)。

表3 復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)4 種病原菌的MIC 和MBC

3 小結(jié)與討論

本研究采用滴定法建立了牛至油復(fù)合納米乳液的偽三元相圖，對(duì)牛至油復(fù)合納米乳液的配方進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳配方，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)試。觀察結(jié)果表明，以吐溫-80 為表面活性劑時(shí)，所形成的納米乳液的表面積最大，說(shuō)明所形成的納米乳液體系更穩(wěn)定，因此選擇了乳化能力強(qiáng)、高安全性的吐溫-80 作為表面活性劑，無(wú)水乙醇作為表面活性劑，牛至油和丁香酚作為油相，蒸餾水作為水相。采用偽三元相圖優(yōu)化配方。結(jié)果表明，當(dāng)Km為3∶1時(shí)，所形成的納米乳液透明、穩(wěn)定。由于醋酸氯乙酯可以溶解在無(wú)水乙醇中，因此將牛至油復(fù)合納米乳液溶解在無(wú)水乙醇助表面活性劑中，最終制備出復(fù)方牛至油納米乳液。用透射電鏡對(duì)復(fù)方牛至油納米乳液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)液滴呈球形、分布均勻、無(wú)黏附、粒徑分布窄。亞甲基藍(lán)是水溶性染液，蘇丹紅Ⅲ是油溶性染液，本研究制備的復(fù)方牛至油納米乳液，亞甲基藍(lán)染液在其中的擴(kuò)散速度比蘇丹Ⅲ染液快，故判定為水油型（O∕W）納米乳液。試驗(yàn)結(jié)果表明，牛至油復(fù)合納米乳液在光照、高速離心、加速、長(zhǎng)期試驗(yàn)過(guò)程中均呈現(xiàn)淡黃色透明液體。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，液滴粒徑略有增大，但變化不明顯，始終在納米乳液的粒徑范圍內(nèi)，說(shuō)明該制劑具有良好的貯存穩(wěn)定性。綜上所述，本研究制備的復(fù)方牛至油納米乳液是一種淡黃色透明液體制劑，液滴平均粒徑33.4 nm，該制劑制備工藝簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、性能穩(wěn)定、質(zhì)量可控，工業(yè)生產(chǎn)方便［10-14］。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乳酸鏈球菌和乳酸鏈球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原微生物。使用抗生素治療奶牛乳腺炎會(huì)導(dǎo)致藥物在牛奶中殘留，危及消費(fèi)者的健康。中藥治療奶牛乳腺炎療效高，復(fù)發(fā)率低，奶中無(wú)藥物殘留，是生產(chǎn)綠色食品的最佳選擇。許多中草藥具有抗菌作用，其中有些甚至優(yōu)于抗生素。因此，從中藥中尋找替代抗生素的藥物用于治療奶牛乳房炎，不僅可以促進(jìn)乳品工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且可以減少抗生素的殘留，具有很大的潛力，還可維護(hù)和提高消費(fèi)者的生活質(zhì)量。該研究通過(guò)打孔法和試管濃度稀釋法測(cè)定了復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)奶牛乳房炎病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌的體外抗菌活性，2種試驗(yàn)結(jié)果基本一致，均表明復(fù)方牛至油納米乳液對(duì)引起奶牛乳腺炎常見(jiàn)病原菌具有良好的抑菌和殺菌效果。該研究為臨床防治奶牛乳房炎中藥納米制劑的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。