當(dāng)歸治療乳腺癌網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制研究

摘 要：運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討當(dāng)歸治療乳腺癌的作用機制。運用中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）設(shè)定藥物口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，篩選出當(dāng)歸125種活性成分，通過GeneCards、OMIM 等數(shù)據(jù)庫查尋乳腺癌基因。使用Cytoscape軟件構(gòu)建當(dāng)歸治療乳腺癌的“成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，將關(guān)鍵核心靶點導(dǎo)入STRING庫，繪制蛋白質(zhì)互作（PP2）網(wǎng)絡(luò)圖，對PPI可視化分析。對核心靶點進(jìn)行GO、KEGG分析，探究當(dāng)歸治療乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。篩選出當(dāng)歸主要有效活性成分2個，作用于40個靶標(biāo)，GO功能富集提示的生物學(xué)過程及功能集中在G蛋白偶聯(lián)胺受體活性（9個蛋白）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個蛋白）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個蛋白）、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（7個蛋白）等。KEGG分析揭示當(dāng)歸治療本病主要以Ca信號、p53信號、Estrogen信號等通路為主。通過本次研究可探討當(dāng)歸治療乳腺癌的機制，為新藥等研發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；乳腺癌；網(wǎng)絡(luò)藥理；有效成分；靶點

中圖分類號：R258

全球乳腺癌（HCC）是婦科疾病中最常見、最多發(fā)的惡性腫瘤之一[1]，目前根據(jù)美國癌癥協(xié)會2019年相關(guān)統(tǒng)計，美國女性乳腺癌的新發(fā)病例在其他癌癥類型中位居首位[2]。生活節(jié)奏的加快、生活方式的改變，以及生活壓力的增大，導(dǎo)致中國乳腺癌的發(fā)病率逐年呈增高態(tài)勢[3]。隨著臨床上針對乳腺癌手術(shù)、化療、內(nèi)分泌等多種診療模式的高速發(fā)展，該病死亡率已逐年遞減，但2020年全球范圍女性因乳腺癌死亡的病人大約有69萬人[4]。現(xiàn)代醫(yī)家將“乳石癰”“乳巖”“奶巖”等中醫(yī)病名歸乳腺癌范疇內(nèi)，其病位涉及的臟腑主要為肝、脾、腎。乳腺癌的主要病機是氣滯血瘀痰凝，機體的氣血運行不暢，氣血瘀滯最終形成“瘤”[5-6]。尋找高效低毒的藥物是科研人員亟須解決的熱點問題。

當(dāng)歸首載《神農(nóng)本草經(jīng)》，是傘形科屬植物當(dāng)歸 Angelica sinensis（Oliv.）Diel 的干燥根[7]，主產(chǎn)甘肅。秋末采挖，采挖后去除泥沙和根須，捆成小把，用煙火緩緩熏干，切成片，生用或酒炙。藥性：甘、辛、溫。歸肝、心、脾經(jīng)。補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，多糖為當(dāng)歸的主要有效成分，主要包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖等糖類，當(dāng)歸多糖可抑制腫瘤生長，增加機體巨噬細(xì)胞的數(shù)目、增強機體的吞噬功能[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是現(xiàn)代新發(fā)展起來專門研究中藥藥理的熱門領(lǐng)域，整合了現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)和中藥藥理學(xué)，以促進(jìn)中藥以發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和治療疾病機制的研究[9]?；谠撗芯靠煞从持兴幓衔锱c疾病靶點之間的相互作用[10]，如治療疾病機制闡釋，中藥藥理作用的預(yù)測和潛在成分的篩選等[11]。該研究將中藥中各化合物與疾病的相互作用網(wǎng)絡(luò)集合生成網(wǎng)絡(luò)圖[12]，促使我們更直觀地發(fā)現(xiàn)中藥和疾病之間的相互作用，也促使我們從宏觀的角度理解中藥，為研究中藥復(fù)雜的作用機制提供了新思路和新方法[13]。因此，本研究對當(dāng)歸的有效化學(xué)成分進(jìn)行分析，更科學(xué)、更深層次的闡釋了當(dāng)歸治療乳腺癌的作用機制，為進(jìn)一步探索當(dāng)歸治療乳腺癌的作用機制奠定基礎(chǔ)[14]。

1 資料與方法

1.1 當(dāng)歸活性成分篩選

運用中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）[15]（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“當(dāng)歸”為關(guān)鍵檢索詞，檢索到當(dāng)歸全部有效活性化學(xué)成分，依據(jù)藥物口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）值≥0.18[16]，進(jìn)一步篩選出當(dāng)歸中DL和OB較好的優(yōu)效化合物。

1.2 當(dāng)歸成分獲取與收集

將得到的“當(dāng)歸”主要活性成分，導(dǎo)入Perl軟件校正，校正當(dāng)歸靶點的名稱，構(gòu)建主要有效活性成分的靶點庫。

1.3 乳腺癌靶點構(gòu)建

通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM（http：/ /www.omim.org/）[17]，GeneCards （https：//www.genecards.org/）[18]查找該疾病的靶點，將收集好的靶點整理，使用R語言進(jìn)行分析，先將Venny包導(dǎo)入R語言中，將藥物主要有效活性成分與乳腺癌疾病靶點取交集，獲得當(dāng)歸治療乳腺癌的核心靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將藥物靶點、成分、疾病基因等導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件（http：//www.cytoscape.org）[19]中，構(gòu)建出“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。該圖揭示了藥物-靶點-疾病之間的關(guān)聯(lián)及相互作用，可進(jìn)一步探討當(dāng)歸治療乳腺癌的機制。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖

將當(dāng)歸治療乳腺癌的核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[20]（https：//string-db.org），繪制分析蛋白質(zhì)之間的作用。將篩選蛋白質(zhì)的條件設(shè)置“MultipleProteins”“物種”設(shè)定為人類（Homo Sapiens），將當(dāng)歸治療乳腺癌的核心靶點導(dǎo)入STRING系統(tǒng)，設(shè)定分值＞0.9，并隱藏游離蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相關(guān)作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖之外的點蛋白，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 生物功能注釋（GO）及通路分析（KEGG）

將得到的核心靶點運用R語言進(jìn)行GO注釋和KEGG進(jìn)行富集分析，得到的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。 P＜0.05為篩選條件，分析生物學(xué)過程與篩選通路，繪制成氣泡圖并進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸活性成分篩選

通過TCMSP檢索到當(dāng)歸全部有效有化學(xué)成分125個，依據(jù)OB≥30%和 DL≥0.18進(jìn)行篩選，得到主要潛在的有效活性化學(xué)成分2個，見表 1。

2.2 當(dāng)歸治療乳腺癌潛在靶點

當(dāng)歸主要潛在的有效活性成分2個，利用GeneCards 和OMIM 收集乳腺癌基因靶點，合并剔除重復(fù)的靶點。運用R語言安裝“VennDiagram”程序包，將當(dāng)歸和疾病關(guān)鍵靶點取交集，得到當(dāng)歸治療乳腺癌的核心靶點，并繪制韋恩圖（圖 1）。獲得關(guān)鍵核心靶點共用40個。

2.3 當(dāng)歸治療乳腺癌網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將當(dāng)歸的化學(xué)成分、靶點，疾病基因等導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，繪制藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），不同的節(jié)點代表不同的意義。

2.4 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將當(dāng)歸治療乳腺癌的共同核心靶點上傳到在線STRING 蛋白庫中，評分值設(shè)置為＞0.9，將PPI游離的單個蛋白予以隱藏，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖 3）。該PPI圖中蛋白節(jié)點有40個，邊數(shù)為117條，蛋白平均度值為5.85。蛋白邊數(shù)越多，揭示該節(jié)點對應(yīng)的相關(guān)靶點的地位作用越顯著。通過R語言得到關(guān)鍵靶點的條形圖（圖4）。結(jié)果揭示ADRA2A、ADRA1B、CASP3、JUN、MAOA等蛋白的度值較其他蛋白高，揭示了這些蛋白在疾病中的作用越顯著，也是和其他蛋白互通的紐帶。

2.5 生物功能及通路分析

在R語言中安裝“clusterProfiler”生物程序包，利用該包Bioconductor 的 GO 注釋信息和 KEGG 庫進(jìn)行富集分析。GO 揭示當(dāng)歸治療乳腺癌形成的關(guān)鍵靶點，富集顯著的前10個生物學(xué)功能主要為G蛋白偶聯(lián)胺受體活性（9個蛋白）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個蛋白）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（7個蛋白）、被動跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（7個蛋白）、蛋白質(zhì)異二聚活性（6個蛋白）、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（6個蛋白）、G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（5個蛋白）、乙酰膽堿受體活性（5個蛋白）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（5個蛋白）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（5個蛋白）。表明當(dāng)歸主要潛在有效成分可以通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑而發(fā)揮治療乳腺癌的作用（圖5）。

通過KEGG富集分析，按照P值＜0.01篩選出3條通路。結(jié)果表明，基因顯著富集在鈣信號通路（8個基因靶點）、p53信號通路（5個基因靶點）、Estrogen信號通路（6個基因靶點），如圖6所示。

3 討論

當(dāng)歸主要活性成分中β-谷甾醇可通過抑制PI3K/Akt 通路，逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化，同時誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡而抑制其轉(zhuǎn)移[21]。

研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合域ADAR1對暴露于8-Cl-Ado的乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞生長抑制至關(guān)重要。8-Cl-Ado共同抑制細(xì)胞增殖，至少通過靶向ADAR1/p53/p21信號通路誘導(dǎo)G1期阻滯和凋亡[22]。研究揭示了Met-和p53介導(dǎo)的信號通路之間的串?dāng)_，這些信號通路在基因調(diào)控中起著重要作用，具有管腔祖細(xì)胞功能。特別是，它表明p53的缺失既不是單獨的，也不是與Met信號結(jié)合的激活導(dǎo)致管腔祖細(xì)胞中早期可檢測到的細(xì)胞命運改變?？梢韵胂?，還需要其他活動為管腔源性TNBC賦予基礎(chǔ)特異性特征。這是第一項在乳腺癌外顯體中發(fā)現(xiàn)核因子MTA1的研究，證明了MTA1通過外顯體轉(zhuǎn)移，并表征外顯子MTA1如何影響癌癥信號通路。這項工作表明，外顯子介導(dǎo)的MTA1是乳腺癌的重要驅(qū)動力靶向外顯子MTA1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的進(jìn)展和機制或活動是乳腺癌潛在的治療策略[23]。在乳腺癌患者中對hnRNPK進(jìn)行免疫定位，這表明hnRNPKERα陽性癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)性顯著較高，而ERα陽性癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)性顯著較低，Ki67陽性或增殖性癌細(xì)胞。這些結(jié)果表明hnRNPK直接相互作用與ERα結(jié)合，參與乳腺癌ER介導(dǎo)的信號通路。此外，hnRNPK表達(dá)可能是ERα陽性患者內(nèi)分泌治療的另一個靶點乳腺癌[24]。

總之，乳腺癌的病因多樣、發(fā)病機制未闡明、病情變化迅速、病程進(jìn)展快、治療療效不佳，目前仍是全球性難題。西醫(yī)主要以手術(shù)、放化療等治療為主，仍存在一定的局限性，當(dāng)歸以“多成分、多靶點、多通路”的特點在乳腺癌防治方面呈現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。本次研究分析當(dāng)歸對治療乳腺癌的有效主要活性成分、關(guān)鍵核心靶點和主要通路，得到了治療乳腺癌的關(guān)鍵核心靶點、生物分子及通路，一方面從微觀方面佐證了當(dāng)歸治療乳腺癌的作用機制；另一方面本次研究的結(jié)果可指導(dǎo)研究者開展實驗研究驗證，為更深層次的闡明當(dāng)歸治療乳腺癌作用機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

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△通信作者：吳紅彥，主任醫(yī)師，從事中醫(yī)老年病學(xué)研究，E-mail：wu.hy@163.com。