昆蟲細胞無血清培養(yǎng)的研究進展及應用

黎宏 郭清源 郭拉楊 扶星星

摘 要：隨著生物工程技術的快速發(fā)展，細胞工程愈來愈受到重視。昆蟲細胞培養(yǎng)技術作為生物工程的新領域，在現(xiàn)代生物學上具有重要的價值，其中以昆蟲桿狀病毒為載體，以昆蟲細胞為受體的基因工程研究也取得了突破性的進展。體外培養(yǎng)的昆蟲細胞可以高效地表達外源基因，且昆蟲桿狀病毒具有對人畜無害等特點，使得昆蟲細胞培養(yǎng)技術廣泛地應用于生物學、醫(yī)藥學和農業(yè)等各個領域。本文綜述了昆蟲細胞培養(yǎng)的研究進展，其中包括了體外培養(yǎng)昆蟲細胞培養(yǎng)基的基礎成分及無血清培養(yǎng)基的添加物、生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細胞和昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)及其應用，為昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基的研發(fā)提供了理論依據。

關鍵詞：昆蟲細胞；桿狀病毒；無血清培養(yǎng)；大規(guī)模培養(yǎng)

中圖分類號：Q813.1+1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.002

Research Progress and Application of Serum-free Culture of Insect Cells

LI Hong， GUO Qingyuan， GUO Layang， FU Xingxing*

（Sichuan Benoji Technology Co.， Ltd.， Mianyang 621000， China）

Abstract： With the rapid development of the field of bioengineering， cell engineering has been paid more and more attention. Insect cell culture technology， as a new field of bioengineering， has important value in modern biology， among which the genetic engineering research using insect baculovirus as the carrier and insect cells as the receptor has also made breakthrough progress. Insect cells cultured in vitro can express foreign genes efficiently， and insect baculoviruses are harmless to humans and animals， which makes insect cell culture technology being widely used in various fields such as biology， medicine and agriculture. In this paper， the research progress of insect cell culture is reviewed， including the basic components of insect cell culture medium in vitro， the addition of unclear medium， the bioreactor for the large-scale culture of insect cellss and the vector system of insect baculovirus expression and its application. It provides a theoretical basis for the development of serum-free culture medium for insect cells.

Key words： insect cells; baculovirus; serum-free culture; mass cell culture

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 200-207）

昆蟲細胞培養(yǎng)始于1915年，理查德·戈德施密特［1］使用惜比古天蠶蛾（Hyalophora cecropia）的精子進行體外培養(yǎng)并成功保持了惜比古天蠶蛾的精子活性，但是由于沒有適合的培養(yǎng)基用于細胞體外培養(yǎng)，所以沒有看到細胞分裂；1962年Grace建立了世界上第一個細胞系［2］，昆蟲細胞系的建立工作開始在世界范圍內廣泛的開展。昆蟲細胞體外培養(yǎng)越來越受到人們的重視，其原因主要在于昆蟲多角體病毒（insect polyhedral virus）可以高水平地表達蛋白，也可以用其基因片段來構建重組病毒，高效表達外源基因，生產某些藥用蛋白［3］；此外，桿狀病毒可以引起昆蟲流行病，但對人畜和植物無害。所以昆蟲細胞體外培養(yǎng)正廣泛應用于疫苗開發(fā)、基因治療、外源蛋白篩選等領域。目前已經建立了很多的昆蟲細胞系，其中研究和應用最多的昆蟲細胞系是草地貪葉蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢細胞系Sf21及其分離株Sf9和粉紋夜蛾［Plusiani （Hubner）］胚胎細胞系High Five［4］。

1 昆蟲細胞培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基既為細胞提供了生長和繁殖的生存環(huán)境，也提供了細胞生長和增殖過程中所需的營養(yǎng)物質［5］。糖類是大部分昆蟲細胞主要的碳源和能源物質，昆蟲細胞生長雖然也能利用部分蔗糖，但是蔗糖在培養(yǎng)基中的主要作用是調節(jié)滲透壓。維生素是維持細胞生長的一類重要生物活性物質，除了在細胞中形成酶的輔基或輔酶外，還對促進昆蟲細胞生長和黏附具有積極作用。不同種類的昆蟲細胞對氨基酸的需求是不一樣的，其中有14種氨基酸是細胞本身不能合成，只能由培養(yǎng)基提供的。幾乎所有的昆蟲細胞對谷氨酰胺（glutamine）都有較高的要求。谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質的重要材料，但是昆蟲細胞自身合成的谷氨酰胺沒有直接從培養(yǎng)基中攝取有效，所以昆蟲細胞培養(yǎng)基中都含有較高濃度的谷氨酰胺［6］。昆蟲細胞需要較高濃度的滲透壓，所以昆蟲細胞培養(yǎng)基中的無機鹽濃度較高，且各無機鹽離子之間需要平衡，如某些細胞系對Na+/K+的比例有嚴格要求。此外，一般認為泛酸（pantothenic acid）、異己酸（isocaproic acid）、乙酸（acetic acid）、核黃素（lactochrome）對細胞的存活是有利的，而膽堿（bilineurine）、吡哆醇（pyridoxol）、維生素B1（vitamin B1）、煙酰胺（nicotinamide）可促進細胞增殖。對昆蟲細胞新陳代謝的研究為設計開發(fā)適合昆蟲細胞生長增殖的培養(yǎng)基提供了基本的理論依據，同時，設計合理的培養(yǎng)方案對實現(xiàn)高產量的桿狀病毒表達是十分重要的。

2 昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基的添加物

昆蟲細胞培養(yǎng)技術發(fā)展很快，在經歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基等階段后，無血清培養(yǎng)基成為昆蟲細胞培養(yǎng)基的發(fā)展趨勢。雖然血清對細胞的生長增殖具有很好的促進作用，但是使用血清存在很多問題［7］：血清的成本高，來源有限，無法大量使用；不同批次生產的血清質量差別很大；血清的成分復雜且不明確，對后期產物的分離、提純及檢測造成一定影響；同時，血清是支原體和其他病毒污染的重要來源。而無血清培養(yǎng)基是不添加動物來源血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的培養(yǎng)基。所以無血清培養(yǎng)基具有化學成分明確、較小的批間差異、減少了外源污染的風險、有利于細胞培養(yǎng)產物的分離純化、降低了成本等區(qū)別于有血清培養(yǎng)基的優(yōu)點［8］。

血清成分復雜，發(fā)展無血清培養(yǎng)基，必需尋找適當的具有類似于血清功能的因子，但是想要找到血清的替代物是相當困難的［9］。目前，大多數商品化的無血清培養(yǎng)基價格較貴，且僅有液體供應，導致此類培養(yǎng)基的保存和應用都受到影響；而且大多數商品化的無血清培養(yǎng)基都含有水解乳蛋白（hydrolyzed milk protein）、酵母提取物和脂類復合物等生物活性物質，雖然其成分相對穩(wěn)定，但依然不明確，對于其中一些添加物的成分和作用機理還不夠了解。因此，還需加深細胞代謝及各成分的作用機理的研究，找到適合的成分明確的替代物。迄今為止，人們已經發(fā)現(xiàn)許多因子單獨或一起使用可以替代血清，其中水解乳蛋白和酵母提取物是昆蟲細胞培養(yǎng)基中最常用的添加物質。水解乳蛋白是氨基酸的主要來源，酵母提取物是維生素和嘌呤堿基的主要來源。激素和生長因子有利于維持細胞生存和增殖，如雌二酮、孕酮等是無血清培養(yǎng)基中經常添加的補充因子，胰島素與細胞上的胰島素受體結合后可促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，是重要的培養(yǎng)基添加物。在培養(yǎng)基中添加結合蛋白也是很有必要的。經常添加的結合蛋白是轉鐵蛋白和白蛋白，其中轉鐵蛋白可以促進細胞生長，白蛋白可以結合毒素和減輕蛋白酶對細胞的影響，還可以通過與維生素、脂類、金屬離子、激素、生長因子［10］結合，調節(jié)和穩(wěn)定其在培養(yǎng)基中的活性作用。另外，微量元素也是細胞代謝所必需的，是細胞體外培養(yǎng)的重要添加因子，可以促進細胞黏附和增加細胞的終產量。在含有血清的培養(yǎng)基中，微量元素主要由血清提供，所以在研究無血清培養(yǎng)基時應添加適當的微量元素。昆蟲細胞所需的微量元素主要包括Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Al3+等，其中Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Al3+能促進細胞黏附和增加細胞的終產量，Al3+和Zn2+可以促進病毒的感染和復制［11］。

3 生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細胞

自1956年Waytt發(fā)明昆蟲組織培養(yǎng)液以來，昆蟲細胞培養(yǎng)規(guī)模不斷地擴大，由最開始的靜止培養(yǎng)，發(fā)展到搖瓶培養(yǎng)，乃至大規(guī)模生物反應器［12］。大規(guī)模生物反應器培養(yǎng)細胞的兩種基本培養(yǎng)模式是懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)［13］。細胞培養(yǎng)的操作方式在很大程度上取決于生物反應器的細胞培養(yǎng)模式，高效的培養(yǎng)方法是昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)的關鍵［14］。昆蟲細胞的培養(yǎng)方法與哺乳動物細胞的培養(yǎng)方法基本相似，相對于哺乳動物細胞，昆蟲細胞更耐剪切力，而且培養(yǎng)過程中不需要CO2，但昆蟲細胞在培養(yǎng)過程中需氧量很高，大量輸氧操作如攪拌、噴氣等都是必需的。但這些操作產生的剪切力往往會引起細胞的損傷和死亡，并且已經成為限制昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)的關鍵因素。想要提高懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞密度，需要從生物反應器的設計、氧氣轉運、剪切力的強弱、細胞接種密度、培養(yǎng)基組分等多個方面考慮［15］，這些敏感性問題的解決直接影響昆蟲細胞的大規(guī)模培養(yǎng)效果。而病毒感染復數、病毒感染時間、細胞密度等則是影響桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達的關鍵因素［16］。張艷艷等［17］在昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)分泌表達的豬瘟病毒E2蛋白及其免疫原性的研究中，采用CSFV石門強毒株（Rb-E2）來表達CSFV E2蛋白，細胞在72 ～ 96 h發(fā)生病變，之后再按10%的比例擴增；7 d后測得病毒滴度為107.8 ?TCID50 /mL；用病毒感染復數為2的量進行轉染，96 h收獲的蛋白質量濃度為50 ?g/mL。最理想的生物反應器培養(yǎng)方式應既能提高細胞密度又能增加表達產物，還能夠降低生產成本。

4 昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)

昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)是以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細胞為受體的表達系統(tǒng)［18］。表1列舉了一些桿狀病毒宿主細胞的來源及應用。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內外廣泛應用的真核表達系統(tǒng)，是利用桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動因子構建的表達系統(tǒng)，可以使很多真核目的基因得到高水平表達［19］。

相對于以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)和包括酵母和哺乳動物在內的真核表達系統(tǒng)，昆蟲桿狀病毒作為外源基因表達載體的優(yōu)勢在于：桿狀病毒基因組較小，分子生物學特性比較簡單，并且基因組上有多種限制性內切酶酶切位點，易于操作；同時，桿狀病毒的病毒粒子是桿狀的，容納外源基因的可塑性比較強，理論上它能容納任何外源基因；此外，桿狀病毒基因中p10基因和多角體蛋白基因都是極晚期基因，它們的啟動子能夠高效地表達目的蛋白；桿狀病毒的宿主為昆蟲細胞，目的蛋白可以利用昆蟲細胞的翻譯后修飾系統(tǒng)進行加工和修飾；桿狀病毒表達載體特異性非常強，只能夠在昆蟲細胞中進行復制，安全性高。與哺乳動物細胞比較，昆蟲培養(yǎng)細胞系相對更容易生長，而且昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)既可采用不同的重組病毒同時感染細胞的形式，也可以采用在同一載體上同時克隆多個外源基因的形式［21］。

目前使用最為廣泛的昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)（Bac-to-Bac系統(tǒng)［22-23］）。該系統(tǒng)由美國Gibcobrl公司開發(fā)，是一個由桿狀病毒表達載體和宿主兩個部分組成的二元系統(tǒng)，其中，桿狀病毒表達載體主要有兩個功能：一個功能是將編碼目標蛋白質的外源基因導入宿主細胞中；另一個功能是為在晚期或極晚期啟動子控制下的目標基因的轉錄提供所需的轉錄復合物。宿主通常是鱗翅類昆蟲細胞系，有時是鱗翅類的昆蟲。Bac-to-Bac桿狀病毒表達載體系統(tǒng)需要先在大腸桿菌系統(tǒng)中生產重組病毒，篩選純化后再轉染昆蟲細胞。如圖1所示：桿狀病毒載體系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEV）生產SARS-CoV-2蛋白的過程中，編碼SARS-CoV-2蛋白的桿狀病毒載體被轉化至感受態(tài)大腸桿菌，在大腸桿菌中發(fā)生了易位，編碼SARS-CoV-2蛋白的基因從供體質粒轉移到宿主質粒，而該質粒從大腸桿菌中提取，用于轉染昆蟲細胞，生成重組桿狀病毒；重組桿狀病毒進一步擴增，擴大重組蛋白的產量，在生物反應器或蠶幼蟲中生產大量的蛋白質，最后在對蛋白質進行純化和分析之后進行各種應用。

與其他3種傳統(tǒng)的基因工程表達系統(tǒng)相比（表2），昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)雖然有自己的特點和優(yōu)勢，但仍存在不足：昆蟲細胞表達系統(tǒng)是一個瞬時表達系統(tǒng)，且表達載體的啟動子為晚期啟動子，表達時限是從感染后的22～24 h開始到宿主細胞死亡，蛋白高水平表達時間很短；昆蟲細胞一般不提供復雜的N-糖基化，雖然這種類型的N-糖基化通常足以提供有生物活性的蛋白產物，但是末端缺乏復雜糖基化有可能影響蛋白的溶解性和穩(wěn)定性；桿狀病毒高水平表達蛋白的同時會致使細胞翻譯后修飾的速度跟不上表達的速度，可能會降低產生表達后修飾蛋白；目前昆蟲細胞多采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，但由于沒有血清蛋白的保護，產物水解問題嚴重。

5 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的應用

基于昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)［26］自身的特點和優(yōu)勢，它被廣泛應用于藥物研發(fā)、疫苗生產、重組病毒殺蟲劑等眾多領域（圖2為桿狀病毒技術的主要應用示意圖）。

由于昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)具有重組蛋白表達量高、適合大規(guī)模生產等優(yōu)勢，其在疫苗研發(fā)領域也獲得了廣泛應用［27］。已有批準文號的相關疫苗產品有豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒滅活疫苗、兔病毒性出血癥桿狀病毒載體滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒2型豬肺炎支原體二聯(lián)滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗和水貂腸炎病毒桿狀病毒載體滅活疫這5種，其具體申報的廠家和批準時間如表3所示。

正在申報臨床的相關疫苗產品有32個，其中包括：瑞普生物申報的豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌三聯(lián)滅活疫苗；齊魯動保申報的兔病毒性出血癥病毒桿狀病毒載體、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗；齊魯動保、天康生物、吉林和元、華威特和大北農申報的豬圓環(huán)病毒2型桿狀病毒載體滅活疫苗等疫苗產品（表4）。

另一方面，由于昆蟲桿狀病毒對許多害蟲比較敏感，將其作為微生物殺蟲劑具有優(yōu)越的性能。其作用機理如圖3所示：通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，通過DNA損傷誘導細胞周期阻滯，通過mTOR途徑誘導自噬或誘導昆蟲細胞壞死。將昆蟲桿狀病毒作為殺蟲劑具有以下2點優(yōu)勢：1）對人畜、環(huán)境等其他非目標昆蟲的影響很小，是生產綠色食品必不可少的生物農藥；2）昆蟲桿狀病毒產生的包含體具有侵染性病毒顆粒，不僅對環(huán)境中的生物穩(wěn)定性具有一定的作用，而且也便于使用傳統(tǒng)技術來制造和應用。

6 總結與展望

昆蟲細胞培養(yǎng)基的發(fā)展相對于哺乳動物培養(yǎng)基起步較晚，但隨著昆蟲細胞培養(yǎng)技術、基因工程和分子生物技術突飛猛進的發(fā)展，昆蟲細胞系已被越來越廣泛地應用于各個研究領域。隨著昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)研究的不斷深入，昆蟲細胞的規(guī)?；偷统杀九囵B(yǎng)成為可能。昆蟲無血清培養(yǎng)基不僅可以降低成本，還減少了異源物污染的可能性，具有很好的發(fā)展前景。要使昆蟲細胞培養(yǎng)技術在基礎研究和產業(yè)化方面得到更廣泛的應用，需要從以下2個方面開展工作：其一，開發(fā)生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)工藝技術，并提高產物表達量；其二，研制低成本昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基，進一步降低培養(yǎng)成本，低成本無血清培養(yǎng)基的設計開發(fā)要以成分明確、批間差異小、穩(wěn)定性高、產物效率高、易純化為目標，向著無蛋白、無動物源組分、廣譜的細胞應用范圍的方向發(fā)展。

參考文獻（References）：

［1］ 李守信， 李長友， 鄭桂玲， 等. 昆蟲細胞培養(yǎng)研究進展［J］. 西北農業(yè)學報， 2005， 14（3）： 41-48.

LI Shouxin， LI Changyou， ZHENG Guiling， et al. Progress in insect cell culture［J］. Journal of Northwest Agriculture， 2005， 14（3）： 41-48.

［2］ SMAGGHE G， GOODMAN C L， STANLEY D. Insect cell culture and applications to research and pest management［J］. In vitro Cellular & Developmental Biology-Animal， 2009， 45（3/4）： 93-105.

［3］ 劉春菊， 任煒杰， 王志亮. 桿狀病毒表達系統(tǒng)在獸用亞單位疫苗領域應用的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)， 2013， 40（9）： 101-105.

LIU Chunju， REN Weijie， WANG Zhiliang. Progress in the application of baculovirus expression system in the field of veterinary subunit vaccine［J］. Chinese Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2013， 40（9）： 101-105.

［4］ 李雪菲， 袁琳， 胡海斌， 等. 桿狀病毒表達系統(tǒng)研究進展［J］. 生物學雜志， 2005， 22（6）： 8-10.

LI Xuefei， YUAN Lin， HU Haibin， et al. Progress in baculovirus expression system［J］. Journal of Biology， 2005， 22（6）： 8-10.

［5］ 張松， 喬自林， 王家敏. 無血清培養(yǎng)基的研究進展［J］. 江西畜牧獸醫(yī)雜志， 2018（1）： 4-8.

ZHANG Song， QIAO Zilin， WANG Jiamin. Advances in serum-free media ［J］. Jiangxi Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2018（1）： 4-8.

［6］ 馬偉， 王家敏， 令世鑫， 等. 昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基研究進展［J］. 動物醫(yī)學進展， 2016， 37（2）： 101-104.

MA Wei， WANG Jiamin， LING Shixin， et al. Progress in serum-free medium of insect cells［J］. Advances in Animal Medicine， 2016， 37（2）： 101-104.

［7］ 張佑紅， 朱雄偉， 陳燕. 昆蟲細胞培養(yǎng)及其應用進展［J］. 武漢化工學院學報， 2006， 28（3）： 20-24.

ZHANG Youhong， ZHU Xiongwei， CHEN Yan. Progress in insect cell culture and its application［J］. Journal of Wuhan University of Chemical Technology， 2006， 28（3）： 20-24.

［8］ 曹翠平， 吳小鋒， 魯興萌. 昆蟲細胞無血清培養(yǎng)［J］. 細胞生物學雜志， 2005， 27： 127-132.

CAO Cuiping， WU Xiaofeng， LU Xingmeng. Serum-free culture of insect cells ［J］. Journal of Cell Biology， 2005， 27： 127-132.

［9］ 顧涵英， 馮佑民. 無血清培養(yǎng)基及其主要補充因子［J］. 生物化學與生物物理進展， 1990， 17（4）： 255-259.

GU Hanying， FENG Youmin. Serum-free medium and its main supplementation factors［J］. Biochemical and Biophysical Progress， 1990， 17（4）： 255-259.

［10］ HALTOM A R， JAFAR-NEJAD H. The multiple roles of epidermal growth factor repeat O-glycans in animal development［J］. Glycobiology， 2015， 25： 1027-1042.

［11］ 余澤華， 劉冬連， 陳曲侯. 昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基的研究進展［J］. 生物工程進展， 1995， 39（11）： 45-47.

YU Zehua， LIU Donglian， CHEN Quhou. Progress in serum-free medium of insect cells［J］. Bioengineering Progress， 1995， 39（11）： 45-47.

［12］ 趙利民， 蔣天華， 羅乃杰. 應用激流式生物反應器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞sf9的工藝研究［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2012， 33（8）： 12-13.

ZHAO Limin， JIANG Tianhua， LUO Naijie. Process research of large-scale suspension culture of insect cells sf9 using torrent bioreactor［J］. Shandong Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2012， 33（8）： 12-13.

［13］ MEGHROUS J， AUCOIN M G， JACOB D， et al. Production of recombinant adeno-associated viral vectors using a baculovirus/insect cell suspension culture system： from shake flasks to a 20 L bioreactor［J］. Biotechnology Progress， 2005， 21（1）： 154-160.

［14］ THOMPSON C M， MONTES J， AUCOIN M G， et al. Recombinant protein production in large-scale agitated bioreactors using the baculovirus expression vector system［J］. Methods in Molecular Biology， 2016， 1350： 241-461.

［15］ ELIAS C B， JARDIN B， KAMEN A. Recombinant protein production in large-scale agitated bioreactors using the baculovirus expression vector system［J］. Methods in Molecular Biology， 2007， 388： 225-246.

［16］ MOTOHASHI T， SHIMOJIMA T， FUKAGAWA T， et al. Efficient large-scale protein production of larvae and pupae of silkworm by Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus bacmid system［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005， 326： 564-569.

［17］ 張艷艷， 張靜遠， 廖發(fā)明， 等. 重組桿狀病毒高效表達豬圓環(huán)病毒型蛋白及其免疫特性分析［J］. 中國生物制品學雜志， 2019， 32（1）： 40-45.

ZHANG Yanyan， ZHANG Jingyuan， LIAO Faming， et al. Analysis of swine circovirus type 2 Cap protein by recombinant baculovirus and its immune profile［J］. Chinese Journal of Biological Products， 2019， 32（1）： 40-45.

［18］ CHAMBERS A C， AKSULAR M， GRAVES L P， et al. Overview of the baculovirus expression system［J］. Current Protein & Pepeide Science， 2018， 91： 541-546.

［19］ 凌同. 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究進展與應用［J］. 微生物學免疫學進展， 2014， 42（2）： 70-78.

LING Tong. Progress and application of the insect baculovirus expression system［J］. Progress in Microbiology Immunology， 2014， 42（2）： 70-78.

［20］ 榮芮， 李婷婷， 張玉云， 等. 昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在疫苗研究中的應用進展［J］. 生物工程學報， 2019， 35（4）： 577-588.

RONG Rui， LI Tingting， ZHANG Yuyun， et al. Progress in the application of insect baculovirus expression vector system in vaccine research［J］. Journal of Bioengineering， 2019， 35（4）： 577-588.

［21］ TROMBETTA C M， MARCHI S， MONTOMOLI E. The baculovirus expression vector system： a modern technology for the future of influenza vaccine manufacturing［J］. Expert Review of Vaccines， 2022， 21（9）： 1233-1242.

［22］ 于永利. 昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)與疫苗研制的年回顧［J］. 微生物學免疫學進展， 2015， 43（4）： 1-15.

YU Yongli. A 30-year review of insect baculovirus expression vector systems and vaccine development［J］. Progress in Microbiology and Immunology， 2015， 43（4）： 1-15.

［23］ YE B， ZHAO Z， YUE D， et al. Construction of the antheraea pernyi （Lepidoptera： Saturniidae） multicapsid nucleopolyhedrovirus bacmid system［J］. Journal of Insect Science， 2020， 20（5）： 5.

［24］ AZALI M A， MOHAMED S， HARUN A， et al. Application of baculovirus expression vector system （BEV） for COVID-19 diagnostics and therapeutics： a review［J］. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology， 2022， 20（1）： 98.

［25］ PIDRE M L， ARRIAS P N， AMOR?S MORALES L C， et al. The magic staff： a comprehensive overview of baculovirus-based technologies applied to human and animal health［J］. Viruses-basel， 2022， 15（1）： 80.

［26］ FELBERBAUM R S. The baculovirus expression vector system： a commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors［J］. Biotechnology Journal， 2015， 10： 702-714.

［27］ TARGOVNIK A M， SIMONIN J A， GREGORIO J M C， et al. Solutions against emerging infectious and noninfectious human diseases through the application of baculovirus technologies［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2021， 105（21/22）： 8195-8226.

［28］ HE X， LU L， HUANG P， et al. Insect cell-based models： cell line establishment and application in insecticide screening and toxicology research［J］. Insects， 2023， 14（2）： 104.