TM4SF1在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

張衛(wèi)芳，孫　燕，張偉杰，朱　換，王留興#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū) 鄭州 450052　2)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 北京 100021

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TM4SF1在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

張衛(wèi)芳1)，孫燕2)，張偉杰1)，朱換1)，王留興1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū) 鄭州 4500522)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 北京 100021

關(guān)鍵詞TM4SF1；乳腺癌；轉(zhuǎn)染；細(xì)胞增殖；遷移

摘要目的：探討TM4SF1在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中的表達(dá)情況以及靶向抑制TM4SF1基因后2種細(xì)胞的增殖、遷移能力的變化。方法：采用RT-PCR檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中TM4SF1 mRNA表達(dá)情況，以正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的TM4SF1 mRNA表達(dá)作為參照；應(yīng)用TM4SF1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，應(yīng)用Western blot方法分析轉(zhuǎn)染效果和TM4SF1蛋白表達(dá)情況；CCK-8法檢測(cè)沉默TM4SF1前后2種細(xì)胞增殖能力的變化；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果：MCF-7細(xì)胞中TM4SF1 mRNA表達(dá)量為(1.159±0.218)，MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量為(1.396±0.199)，均高于MCF-10A細(xì)胞中的表達(dá)量(0.016±0.004)(P均<0.05)；且惡性程度較高的細(xì)胞MDA-MB-231高于低度惡性的MCF-7細(xì)胞(P<0.05)。特異性轉(zhuǎn)染TM4SF1 siRNA后，該基因表達(dá)被抑制，同時(shí)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的體外遷移能力下降(P均<0.05)，而細(xì)胞的增殖能力變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：TM4SF1在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中高表達(dá)，并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

Expression of TM4SF1 and its effect on proliferation and migration of human breast cancer cells MCF-7 and MDA-MB-231

ZHANGWeifang1),SUNYan2),ZHANGWeijie1),ZHUHuan1),WANGLiuxing1)

1)WardOneofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021

Key wordsTM4SF1;breast cancer;transfection;cell proliferation;migration

AbstractAim: To explore the expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, and investigate its effect on the proliferation and migration when TM4SF1 was silenced.Methods: The expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 and MDA-MB-231 cells was determined by RT-PCR, and the results were compared with that of MCF-10A cells. RNA interference method was applied to transiently transfect siRNA targeting at TM4SF1 into MCF-7 and MDA-MB-231 cells, the transfection efficiency and the protein expression of TM4SF1 in MCF-7 and MDA-MB-231 cells were analyzed by Western blot, CCK-8 was used to measure the difference of cell proliferation when TM4SF1 was silenced,and the mobility was determined by the scratch test.Results: The expression of TM4SF1 mRNA in MCF-7 cells (1.159±0.218) and in MDA-MB-231 cells (1.396±0.199) were both significantly higher than the expression in MCF-10A cells (0.016±0.004)(P<0.05), and the expression of TM4SF1 mRNA in MDA-MB-231 cells was higher than that in MCF-7 cells (P<0.05). After the TM4SF1 siRNA was transfected into the cells，the TM4SF1 mRNA expression were significantly inhibited, while the capability of migration of the two cells were decreased(P<0.05), and the difference of cell proliferation had no significance(P>0.05).Conclusion: TM4SF1 is highly expressed in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, and enhances the migration of the cells.

乳腺癌是女性最常見的腫瘤[1]。國(guó)內(nèi)外研究[2]表明，TM4SF1與惡性腫瘤的血管形成密切相關(guān)，并可促進(jìn)多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。TM4SF1是四次跨膜蛋白L6超家族成員之一，在肺癌[3]、胰腺癌[4]、前列腺癌[5]等有異常高表達(dá)，在正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈低表達(dá)[6]。該研究通過(guò)檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231中TM4SF1表達(dá)情況，同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染這2種細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化，探討TM4SF1與乳腺癌的關(guān)系，為乳腺癌的臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株及主要材料MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株由鄭州大學(xué)腫瘤干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供，MCF-10A細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；Lipofectamine2000、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏生物制藥有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成；質(zhì)粒siRNA由上海吉瑪公司合成。TM4SF1-siRNA序列為5’-GGCUCUUGGUG GAAUUGAATT-3’(上游)，5’-UUCAAUUCCACCAA GAGCCTT-3’(下游)。NC序列為5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’(上游)，5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’(下游)。CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；兔抗人TM4SF1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下，分別在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640或DMEM/F12培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.4細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)3種細(xì)胞中TM4SF1 mRNA的表達(dá)Trizol法提取3種細(xì)胞總RNA，在冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，行RT-PCR反應(yīng)。TM4SF1引物序列為5’-TGCAGGATCTGGCTACT GTG-3’(上游)，5’-CAGTGCTGGCAAAGGTGTAG-3’(下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小104 bp；β-actin引物序列為5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’(上游)，5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’(下游)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小435 bp。PCR反應(yīng)體系：Real Master Mix 10 μL,引物(10 μmol/L)各0.4 μL,cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL,共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火與延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算3種細(xì)胞中TM4SF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性將細(xì)胞密度調(diào)整為2×104mL-1，接種于96孔板中(每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔)，每孔加入100 μL，細(xì)胞貼壁后，按照前述方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h，加入10 μL/孔的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。重復(fù)3次，取均值，繪制細(xì)胞存活曲線。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2種細(xì)胞的遷移率將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞融合度達(dá)到90%～100%時(shí)，用10 μL槍頭對(duì)細(xì)胞做十字劃痕，PBS洗去脫落的細(xì)胞，采用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于0、24 h拍照，圖像處理軟件測(cè)量寬度，細(xì)胞遷移率=(1-實(shí)驗(yàn)組寬度/對(duì)照組寬度)×100%。重復(fù)3次，取均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3種細(xì)胞TM4SF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞TM4SF1基因沉默前后遷移率的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；SiNC組和SiTM4SF1組細(xì)胞增殖活力的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13種細(xì)胞TM4SF1 mRNA的表達(dá)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A TM4SF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(0.016±0.004)，MCF-7細(xì)胞TM4SF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(1.159±0.218)，MDA-MB-231細(xì)胞TM4SF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(1.396±0.199)(F=150.447，P<0.001)；且兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染SiTM4SF1的細(xì)胞TM4SF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組和SiNC組下降，表明該基因被沉默(表1)。

表1　不同siRNA對(duì)2種

*：與對(duì)照組比較，P<0.05;#：與SiNC組比較，P<0.05。

2.2MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞TM4SF1蛋白的表達(dá)情況結(jié)果見圖1，表明2種細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)染。

左：MCF-7細(xì)胞；右：MDA-MB-231細(xì)胞；1：對(duì)照組；2：SiNC組；3：SiTM4SF1組。圖1　2種細(xì)胞TM4SF1蛋白的表達(dá)情況

2.3沉默TM4SF1基因?qū)CF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖2和表2、3。

圖2　MCF-7 和 MDA-MB-231細(xì)胞TM4SF1基因沉默后細(xì)胞的存活曲線

表2　沉默TM4SF1基因后

表3　沉默TM4SF1基因后不同

2.4沉默TM4SF1基因?qū)?種細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果見表4、圖3。

表4　沉默TM4SF1 基因

1：0 h(×100)；2：24 h(×200)；A：MCF-7 SiNC組；B:MCF-7 SiTM4SF1組；C：MDA-MB-231 SiNC組；D:MDA-MB-231 SiTM4SF1組。圖3　沉默TM4SF1基因后2種細(xì)胞遷移能力的變化

3討論

近些年來(lái)，乳腺癌患者的5 a生存率明顯提高，然而其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是需要解決的嚴(yán)峻問(wèn)題，也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因[6]。研究[7]表明，乳腺癌的復(fù)發(fā)與腫瘤血管的形成密切相關(guān)。而TM4SF1可以作為一個(gè)新的抑制腫瘤血管生成的靶點(diǎn)[8]。TM4SF1為四次跨膜蛋白L6超家族成員之一[2]，其家族成員還包括TM4SF4、TM4SF5、TM4SF18、TM4SF19、TM4SF20等。諸多研究[9-15]證實(shí)，TM4SF1蛋白在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和腫瘤血管形成中扮演著非常重要的角色，且靶向抑制該基因后，癌細(xì)胞的遷移和侵襲功能均明顯下降。

該研究結(jié)果顯示，TM4SF1 mRNA在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞MCF-7中高表達(dá)，兩者的表達(dá)水平明顯高于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的表達(dá)水平，且MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)水平高于MCF-7細(xì)胞的表達(dá)水平。特異性轉(zhuǎn)染TM4SF1 siRNA后，其表達(dá)被顯著抑制，同時(shí)2種癌細(xì)胞的體外遷移能力明顯下降，而細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯變化?；谠搶?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測(cè)TM4SF1基因可能和腫瘤細(xì)胞惡性程度的高低密切相關(guān)，未來(lái)可作為一種預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。相關(guān)詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)R737.9

#通信作者，男，1952年2月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：wlx2246@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.025