昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在動物疫苗研究的應(yīng)用

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(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所, 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

0 引言

桿狀病毒表達系統(tǒng)自建立以來廣泛應(yīng)用于生物檢測、疫苗生產(chǎn)、基因治療等方面。昆蟲細胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)提供了一種蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，生產(chǎn)可溶形式的重組蛋白，并能高效表達。表達的蛋白質(zhì)具有大多數(shù)的翻譯后修飾的功能，因此產(chǎn)生的膜蛋白具有正確的折疊構(gòu)象，這是該方法優(yōu)于原核表達系統(tǒng)的主要特點[1]。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)主要是針對桿狀病毒構(gòu)建載體，與哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比大大縮短了從基因克隆到蛋白表達的時間。桿狀病毒基因組較大，能夠克隆大的DNA片段，從而能夠表達復(fù)雜的蛋白質(zhì)聚集體。桿狀病毒不能感染非昆蟲來源的細胞，因此表達系統(tǒng)表達的重組蛋白對人和動物無害。

1 桿狀病毒表達系統(tǒng)生物學(xué)

桿狀病毒(Baculovirus)因病毒呈桿狀而得名，是一種有囊膜包裹的閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒。桿狀病毒主要包括核多角體病毒屬和顆粒體病毒屬，其中核多角體應(yīng)用較廣泛[2]。目前報道桿狀病毒能夠感染600多種昆蟲細胞，無脊椎動物的細胞是其宿主細胞。在Genbank上，可以檢索到多條完整的桿狀病毒基因組序列，雖然不同種類桿狀病毒基因組差別很大，但有近30個參與DNA復(fù)制、表達、病毒入侵及裝配等基因編碼有關(guān)的核心基因，在所有桿狀病毒的基因組中高度保守。此外，調(diào)節(jié)宿主基因表達的蛋白編碼區(qū)的基因序列也相對保守。桿狀病毒在基因表達的極晚期，為了抵御蟲體之間橫向傳播時外界環(huán)境的不利因素，分別受到超強polh啟動子大量合成多角體蛋白(polh)，多角體蛋白形成包裹體基質(zhì)。p10啟動子調(diào)控大量合成P10蛋白，p10蛋白參與包裹體從細胞核中的釋放。桿狀病毒表達系統(tǒng)的基礎(chǔ)是外源基因插入桿狀病毒超強polh啟動子和p10啟動子之后，通過這兩種啟動子來大量表達外源蛋白。缺失這兩種蛋白，桿狀病毒在培養(yǎng)的細胞間和昆蟲體內(nèi)進行傳播不受影響[3]。

2 桿狀病毒表達系統(tǒng)的特點

桿狀病毒表達系統(tǒng)對翻譯后進行加工修飾蛋白機制完善，使表達蛋白形成三級或四級復(fù)雜結(jié)構(gòu)，進而使外源蛋白盡可能有天然蛋白的結(jié)構(gòu)，具有很高的蛋白活性，免疫原性可媲美天然蛋白[4]。桿狀病毒表大系統(tǒng)啟動子能夠高效的驅(qū)動靶基因高效表達，目的蛋白表達量可達到細胞總蛋白的50%左右。桿狀病毒全基因組較大分子量(90～180kb)，具有多個天然強啟動子，可以插入DNA(約10kb)較大片斷的外源基因；并能夠多基因同時表達，實現(xiàn)同時容納多個外源基因。多個基因共表達，可以克服成分單一的亞單位疫苗免疫原性弱的缺點，病毒樣顆粒還可以發(fā)揮佐劑的作用。

桿狀病毒不能感染哺乳動物，對人類沒有致病性，應(yīng)用沒有安全顧慮；使用的昆蟲細胞Sf21，Sf9或High five可在無二氧化碳條件下27℃進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，操作相對簡單，工業(yè)化生產(chǎn)方面具有天然優(yōu)勢。

3 桿狀病毒表達系統(tǒng)在動物疾病研究中的應(yīng)用

2006年勃林格殷格翰公司首次推出豬圓環(huán)2型病毒載體滅活疫苗，于2010年獲農(nóng)業(yè)部批準引入，成為國內(nèi)第一個針對豬圓環(huán)病毒感染的疫苗。疫苗保護力好1針1 mL 2周齡起保護至出欄。在禽流感疫苗研究方面，Rezaei等將重組有禽流感病毒H1N1、H3N2HAs和M1基因的桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，免疫小鼠后攻毒，與對照相比，免疫小鼠并未出現(xiàn)死亡等其他反應(yīng)[5]。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)針對細菌感染的亞單位疫苗的報道較少，僅見到有使用桿狀病毒載體系統(tǒng)表達布魯氏桿菌熱激蛋白的報道。寄生蟲疫苗研究方面，桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)細粒棘球蚴Eg95抗原，具有良好的免疫原性，為優(yōu)化細粒棘球蚴疫苗提供了熱點候選分子之一[6]。目前，桿狀病毒載體系統(tǒng)主要應(yīng)用于動物病毒疫苗的研究，包括口蹄疫病毒、羊痘病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病毒等相關(guān)蛋白均在桿狀病毒系統(tǒng)內(nèi)表達，且被證實可以引起機體產(chǎn)生較高水平免疫應(yīng)答，但大多數(shù)疫苗僅限于實驗室研究。

4 結(jié)語

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，不僅應(yīng)用于亞單位疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)，還應(yīng)用于重組蛋白結(jié)構(gòu)功能研究，作為免疫原制作單克隆抗體，進入某些哺乳動物細胞基因治療、生物防治等領(lǐng)域。

鄭瑾,任斐,余翔,等.利用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)制備 HPV 16 E6 蛋白[J].西北大學(xué)學(xué)報,2008,38(5):775-778.

[2] 李晶梅,靖志強.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗的研究進展[J].中國獸藥雜志,2012,46(12):67-70.

[3] 陳琳,吳小鋒.昆蟲桿狀病毒粒子的蛋白質(zhì)組成及生物學(xué)功能[J].蠶業(yè)科學(xué),2014,40 (3):533-543.

[4] 張民秀,謝芝勛,黃莉,等.H9N2亞型禽流感病毒HA基因在昆蟲細胞中的表達[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2017,36(3):859-864.

[5] Bae JE & Toth TE. Cloning and kinet-ics of expression of Brucella abortus heat shock proteins by baculovirus recombinants[J].Veterinary Microbiol, 2000, 75:199-204.

[6] 周必英,陳雅棠,李文桂.細粒棘球絳蟲 E995 基因工程疫苗研究進展[J].中國地方病學(xué)雜志,2008,27(6):709-711.