沙眼衣原體蛋白酶CPAF的結(jié)構(gòu)特征及抗原表位分析

王道 張宏波 劉文彬 陳建林

摘 要：衣原體蛋白酶樣活性因子（CPAF）是一種沙眼衣原體蛋白酶，其活性可抑制宿主炎癥信號、細(xì)胞骨架重塑和中性粒細(xì)胞活化等過程。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法對CPAF蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、N-糖基化和磷酸化位點(diǎn)、二級/三級結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合區(qū)域和小分子藥物、B/T細(xì)胞抗原表位以及相互作用蛋白等進(jìn)行分析。CPAF由601個氨基酸組成，分子質(zhì)量為67 252.57 Da，理論等電點(diǎn)為5.68，為不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)；含有信號肽，無跨膜區(qū)，保守結(jié)構(gòu)域位于3～586位氨基酸序列，屬于CPAF超家族，主要分布在細(xì)胞質(zhì)；分別存在1個N-糖基化和53個磷酸化位點(diǎn)，二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，存在14個配體結(jié)合位點(diǎn)、20個B細(xì)胞抗原表位、4種B細(xì)胞構(gòu)象抗原表位、多個可能的T細(xì)胞抗原表位。此外，本文還虛擬篩選出5種潛在的有效小分子化合物，CPAF能與htrA、pbpB、recC等10種其他蛋白發(fā)生互作關(guān)系。這為深入研究CPAF蛋白在沙眼衣原體發(fā)病機(jī)制中的重要作用提供了理論依據(jù)，使其可能成為疫苗研發(fā)和藥物治療的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：沙眼衣原體；CPAF蛋白；生物信息學(xué)；結(jié)構(gòu)；抗原表位

中圖分類號：R374 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.008

Analysis of Structure Features and Epitopes of Chlamydia trachomatis Protease CPAF

WANG Dao1， ZHANG Hongbo2， LIU Wenbin3， CHEN Jianlin1*

（1. Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410011， China; 2. Department of Pathology， the Second Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410011， China; 3. State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract： Chlamydial protease-like activity factor （CPAF） is a Chlamydia trachomatis protease， which activity results in dampened host inflammation signaling， cytoskeletal remodeling， and suppressed neutrophil activation. We used series of bioinformatics to analyze and predict CPAF protein， physicochemical properties and hydrophobicity， signal peptide， subcellular localization， transmembrane protein structure， conserved region and N-glycosylation sites and phosphorylation sites， the secondary and tertiary structure， ligand-binding regions and small molecular compounds， B-/T-cell epitopes and the interacting proteins. CPAF， which consist of 601 amino acids， the relative molecular weight is 67 252.57 Da， the theoretical isoelectric point is 5.68. The CPAF protein contains a signal peptide and has non-transmembrane regions. The conserved domain of CPAF protein is located at 3～586 amino acid sequence and belongs to CPAF superfamily. The CPAF protein contains 1 N-glycosylation site and 53 phosphorylation sites. The secondary structure is mainly composed of irregular coiling and α-helix. The CPAF protein contains 14 ligand-binding sites， 20 B-cell epitopes， 4 conformational epitopes and several potential T-cell epitopes， and 5 potentially effective screening small molecule compounds. Meanwhile， CPAF may interact with 10 other proteins including htrA、pbpB、recC and so on. This study provides a theoretical basis for further researching the role of CPAF in the pathogenesis of Chlamydia trachomatis， which could be used as a target for vaccine developments and drug therapies.

Key words： Chlamydia trachomatis; CPAF; bioinformatics; structure; antigenic epitope

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 247-258）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是引起細(xì)菌性性傳播疾?。╯exually transmitted infections，STIs） 的主要病原體之一，據(jù)報道，全球每年感染人數(shù)超過1億［1］。多項研究［2-3］證實，Ct只能在人或動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并能與宿主細(xì)胞的新陳代謝和信號通路相互作用，引起基因表達(dá)的改變，從而阻斷宿主細(xì)胞凋亡。在生殖道感染中，Ct主要在男性尿道上皮和女性子宮內(nèi)膜復(fù)制，造成泌尿生殖道炎癥、水腫以及黏膜分泌物異常，進(jìn)一步感染可導(dǎo)致盆腔炎、輸卵管疤痕、異位妊娠和不孕癥等嚴(yán)重并發(fā)癥［4］。然而，80%女性和50%男性感染后可能沒有任何癥狀，因此，Ct感染長期被人們忽視［5］。但Ct具有高傳播率的特點(diǎn)，高危病人的再感染率和治療失敗導(dǎo)致的反復(fù)感染，使其成為一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生重大威脅。

在早期研究Ct與宿主細(xì)胞的相互作用過程中，一種新的衣原體蛋白酶樣活性因子被Zhong等［6］檢測并鑒定出來，命名為CPAF（chlamydial protease-like activity factor）。CPAF屬于衣原體絲氨酸蛋白酶，由衣原體網(wǎng)狀體（reticulate body，RB）產(chǎn)生，具有多種活性，抑制抗衣原體免疫反應(yīng)［7］。Rajeeve等［8］報道，Ct能通過CPAF干擾化學(xué)介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化，逃避宿主的先天免疫反應(yīng)。Zhang等［9］報道，CPAF能夠選擇性和特異性地降解衣原體T細(xì)胞抗原，以促進(jìn)Ct存活。Cheong等［10］還通過ELISA測定多種細(xì)胞因子，證實了CPAF具有引發(fā)宿主免疫細(xì)胞反應(yīng)的能力。盡管人們一致認(rèn)為CPAF是一個關(guān)鍵的毒力因子，可切割宿主蛋白，其中包括細(xì)胞骨架中間纖維波形蛋白、核膜層黏連蛋白等，但在感染細(xì)胞中CPAF是怎么被激活及其被調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍然不明確。而且，Ct復(fù)雜的二相性發(fā)育周期和血清型變異成為制備抗衣原體疫苗的限制因素。

本課題組Peng等［11］的研究表明，CPAF可以促進(jìn)不依賴C3的C5活化，揭示了活化衣原體感染誘導(dǎo)的新機(jī)制。本文運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站對Ct的CPAF蛋白的理化性質(zhì)、二級/三級高級結(jié)構(gòu)、配體結(jié)合位點(diǎn)、小分子藥物、互作蛋白以及B/T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行綜合解析，為研制CPAF為靶點(diǎn)的抗衣原體疫苗防治性傳播疾病和尋找有效小分子藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）獲取Ct CPAF蛋白的氨基酸序列信息：CT D/UW-3/CX標(biāo)準(zhǔn)株基因組序列號為AE001273.1，CT_858的Gene ID為884659，CPAF蛋白的氨基酸序列登錄號為AAC68456.2。

1.2 方法

1.2.1 CPAF蛋白的理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ExPasy網(wǎng)站的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析CPAF蛋白的理化性質(zhì)；運(yùn)用Protein-Sol軟件（https：//protein-sol.manchester.ac.uk/）分析CPAF蛋白的溶解度。

1.2.2 CPAF蛋白的親/疏水性、信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用ProtScale軟件（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測CPAF蛋白的親/疏水性；利用SignalP 5.0 Serve軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預(yù)測CPAF蛋白的信號肽；利用PSORTII網(wǎng)站（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對CPAF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用TMHMM Server v2.0網(wǎng)站（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）對CPAF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.3 CPAF蛋白的N-糖基化、磷酸化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域分析

利用NetPhos3.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）和NetNGly1.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc-1.0）分別預(yù)測CPAF蛋白的N-糖基化和磷酸化位點(diǎn)。利用NCBI Conserved Domains Database（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）對CPAF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.4 ?CPAF蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)模型

運(yùn)用SOPMA軟件（https：//www.ibcp.fr/predict.html）對CPAF蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；使用SWISS-MODEL構(gòu)建CPAF蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型；采用The Structure Analysis and Verification Serve（https：//saves.mbi.ucla.edu/）對其三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行驗證。

1.2.5 ?CPAF蛋白的抗原表位和抗原決定簇分析

運(yùn)用ABCpred server（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）、ElliPro server（http：//tools.iedb.org/ellipro/）、IEDB（http：//www.iedb.org/）以及SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/）網(wǎng)站對CPAF蛋白的抗原表位進(jìn)行分析。然后，運(yùn)用 Immunomedicine Group（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）對CPAF蛋白的抗原決定簇進(jìn)行分析。

1.2.6 CPAF蛋白的抗原性和致敏性分析

進(jìn)一步運(yùn)用VaxiJen v2.0（www.ddgpharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）和ANTIGENpro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu）對CPAF蛋白的抗原性進(jìn)行分析；使用AllerTOP v2.0和 Allergen FP v1.0預(yù)測CPAF蛋白的過敏性。

1.2.7 CPAF蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測和小分子化合物篩選

將CPAF蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型PDB文件上傳至PrankWeb（https：//www.prankweb.cz/）數(shù)據(jù)庫，對CPAF蛋白表面可能的配體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；使用Discovery Studio 2020 Client 軟件、PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以及PyRx軟件的Vina進(jìn)行TOP5有效化合物篩選。

1.2.8 CPAF相互作用的蛋白質(zhì)預(yù)測

運(yùn)用STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與CPAF蛋白發(fā)生相互作用的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPAF蛋白的理化性質(zhì)和溶解度分析

利用ProtParam網(wǎng)站對CPAF蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：CPAF蛋白由601個氨基酸構(gòu)成，其中亮氨酸（Leu）的數(shù)量為62個（10.3%），含量最高；半胱氨酸（Cys）的數(shù)量為7個（1.2%），含量最低（圖1a）；其中包含69個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）和57個帶正電荷的氨基酸殘基（Arg + Lys）；分子式為C3044H4692N798O890S17，總原子數(shù)為9 441，分子質(zhì)量為67 252.57 Da，理論等電點(diǎn)為5.68；280 nm波長處消光系數(shù)為85 175，吸光度為1.266，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為40.21，推測CPAF為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為88.39，平均總親水值為-0.149。運(yùn)用Protein-Sol Server網(wǎng)站預(yù)測出CPAF蛋白的溶解度為0.229，小于群體平均值（PopAvrSol）0.450，說明該蛋白的溶解度一般（圖1b）。

2.2 CPAF蛋白的親疏水性分析

基于Hydropath/Kyte & Doolittle算法，運(yùn)用ProtScale預(yù)測CPAF蛋白的親疏水性。CPAF蛋白有6個高分值峰區(qū)（Score>1.5），分別在氨基酸的第9～13、89、101、288～290、372～377、496位氨基酸，其中最高分值的氨基酸是第289位氨基酸的異亮氨酸（Score=2.267）；有3個低分值的峰區(qū)（Score<-2），分別在第72～74、76、243～244位氨基酸，其中最低分值的氨基酸是第72位的精氨酸（Score =-2.533）（圖2）。CPAF大多數(shù)氨基酸位于親水區(qū)，推測其是親水性蛋白。

2.3 CPAF蛋白的信號肽、跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位分析

利用Signal5.0分析CPAF蛋白存在的信號肽，在氨基酸序列23和24位點(diǎn)之間有一個裂解位點(diǎn)VQG～ES的概率為95.85%，所以推測該蛋白極大可能產(chǎn)生信號肽（圖3）。同時，TMHMM Serve v2.0預(yù)測表明，CPAF蛋白不存在跨膜區(qū)（圖 4）。PSORTII對CPAF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明，其主要存在于細(xì)胞質(zhì)（56.5%），其次在線粒體（21.7%）和細(xì)胞核（17.4%）。

2.4 CPAF蛋白的糖基化、磷酸化位點(diǎn)以及保守結(jié)構(gòu)域分析

NetNGlyc 1.0 Server 網(wǎng)站分析CPAF蛋白表明，其包含1個可能的N-糖基化位點(diǎn)，閾值設(shè)為0.5（圖 5）；NetPhos 3.1 Server網(wǎng)站預(yù)測CPAF蛋白共有53個磷酸化位點(diǎn)，其中有32個絲氨酸（Serine）磷酸化位點(diǎn)、5個酪氨酸（Tyrosine）以及16個蘇氨酸（Threonine）磷酸化位點(diǎn)（圖6）。運(yùn)用NCBI Conserved Domains Database發(fā)現(xiàn)，CPAF蛋白有1個保守結(jié)構(gòu)域，屬于Chlamy_CPAF超家族（圖 7）。

2.5 CPAF蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

使用SOPMA軟件對CPAF蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其中多肽鏈中α-螺旋229個（38.10%），延伸鏈95個（15.81%），無規(guī)則卷曲247個（41.10%），β-折疊鏈30個（4.99%）（圖8）。運(yùn)用SWISS-MODEL預(yù)測CPAF蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果得到4個模型。根據(jù)建模評價指標(biāo)QMEAN =-1.21（值在-4～0 之間，越接近0匹配度越好）和GMQE = 0.86（值在0～1之間，越接近1則建模質(zhì)量越好），選取模型質(zhì)量最好的結(jié)構(gòu)（圖9a）并且利用拉曼光譜圖進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)僅0.8%的氨基酸殘基分布在不合理區(qū)域，證明該模型具有良好的可靠性（圖9b）。

2.6 CPAF蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)和小分子藥物篩選

基于隨機(jī)森林算法，運(yùn)用PrankWeb網(wǎng)站對CPAF蛋白表面上的配體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，該蛋白表面分別用14種不同顏色代表預(yù)期口袋和實際結(jié)合的可能區(qū)域。蛋白質(zhì)的原子則使用灰色描述，灰色程度越深代表保守性越高。在所有預(yù)測的口袋區(qū)域中，黑色區(qū)（Rank1）口袋得分為5.30，氨基酸殘基數(shù)為12，氨基酸殘基位點(diǎn)為A_378、A_400、A_405、A_406、A_409、A_413、A_450、A_471、A_472、A_527、A_529、A_53；紅色區(qū)（Rank2）口袋得分為5.27，氨基酸殘基數(shù)為11，氨基酸殘基位點(diǎn)為B_400、B_406、B_409、B_413、B_450、B_471、B_472、B_527、B_528、B_529、B_53；黃色區(qū)（Rank3）口袋得分為3.65，氨基酸殘基數(shù)為10，氨基酸殘基位點(diǎn)為A_105、A_375、A_376、A_377、A_378、A_499、A_500、A_503、A_527、A_528；桔色區(qū)（Rank4）口袋得分為3.34，氨基酸殘基數(shù)為10，氨基酸殘基位點(diǎn)為B_118、B_151、B_152、B_159、B_182、B_183、B_185、B_194、B_200、B_216；藍(lán)色區(qū)（Rank5）口袋得分為3.30，氨基酸殘基數(shù)為10，氨基酸殘基位點(diǎn)為B_105、B_374、B_376、B_378、B_499、B_500、B_503、B_526、B_527、B_528。因此，推測黑色區(qū)域是口袋和實際配體結(jié)合最有可能的區(qū)域（圖10）。

圖10 CPAF蛋白的配體結(jié)合區(qū)域分析

Fig. 10 The ligand-binding domains of CPAF

以SWISS-Model同源建模CPAF蛋白的3D結(jié)構(gòu)作為受體蛋白文件（PDB格式），使用Discovery Studio 2020 Client 軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，下載PDB格式文件。然后，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載篩選出重要化合物的2D結(jié)構(gòu)（SDF格式）。最后，使用PyRx軟件內(nèi)部的Vina進(jìn)行對接，篩選結(jié)合能最低（結(jié)合能越低，結(jié)合越穩(wěn)定）的前5種化合物，其中化合物Pubchem CID分別是Imatinib（5 291）、Fluprostenol（4 449）、Nefazodone（528 222 6）、Travoprost（531 122 1）和Latanoprost（531 110 0）（圖11）。

圖11 CPAF蛋白的小分子藥物預(yù)測

Fig. 11 Prediction of small molecules of CPAF

2.7 CPAF蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位分析

運(yùn)用ABCpred Prediction Server 對CPAF蛋白的氨基酸序列進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測（閾值為0.5）。其中分值大于0.5的有52個B細(xì)胞抗原表位，分值大于0.8的有20個B細(xì)胞抗原表位（表2）。根據(jù)結(jié)果綜合分析，推測第375～394、74～93、60～79、414～433、399～418位氨基酸為CPAF蛋白的B細(xì)胞表位的可能性最大。使用ElliPro服務(wù)器的結(jié)果發(fā)現(xiàn)共形成了12個構(gòu)象的B細(xì)胞表位，其中評分有4個（>0.740），分別為 0.828（圖12a）、0.791（圖12b）、0.779（圖12c）、0.747（圖12d）。

運(yùn)用SYFPEITHI對CPAF蛋白的CLT抗原表位進(jìn)行預(yù)測，其中MHC-I類型為HLA-A*02：01，分值大于20以上的有24個（表3）；當(dāng)MHC-II類型為HLA-DRB1*04：01、HLA-DRB1*07：01、HLA-DRB1*01：01、HLA-DRB1*03：01，Th細(xì)胞表位有0個。采用IEDB軟件預(yù)測CPAF蛋白的MHC-I和MHC-II類型的表位：MHC-I型抗原表位（HLA-A*01：01，HLA-A*02：01，HLA-A*03：01）Percentile Rank<1的有45個，其中分?jǐn)?shù)最高的肽段氨基酸，即HLA-A*01：01，Score=0.978，位于第430～438位；HLA-A*03：01，Score=0.972，位于第224～232位；HLA-A*02：01，Score=0.905，位于第379～387位（表 4）；MHC-II類型的表位（HLA-DRB1*03：01和HLA-DRB1*04：01）Adjust-rank<1的有15個（表5）。

2.8 CPAF蛋白的抗原決定簇

利用Immunomedicine Group網(wǎng)站對CPAF蛋白的抗原決定簇進(jìn)行預(yù)測，平均抗原傾向性為1.035 7，共計有23個抗原決定簇表位，主要位于氨基酸序列的第5～46、56～70、78～89、94～116、121～127、136～157等位點(diǎn)，這些位點(diǎn)形成抗原決定簇可能性較高（圖13、表6）。

2.9 CPAF蛋白的抗原性和過敏性分析

鑒于Ct的CPAF蛋白的特點(diǎn)，使用VaxiJen v2.0服務(wù)器對其抗原性進(jìn)行非對齊預(yù)測，閾值設(shè)為0.4，總體預(yù)測的抗原可能性為0.461 4；運(yùn)用ANTIGENpro服務(wù)器驗證CPAF蛋白的抗原性為0.717 4，這兩個結(jié)果都證明CPAF蛋白具有抗原性。使用AllerTOP v2.0和Allergen FP v1.0分別對其進(jìn)行過敏性預(yù)測，結(jié)果都顯示，CPAF蛋白為非過敏原性，不會誘導(dǎo)過敏原特異抗體產(chǎn)生。

2.10 CPAF蛋白的相互作用蛋白

STRING11.5數(shù)據(jù)庫預(yù)測與Ct CPAF蛋白（CT_858）發(fā)生相互作用的高置信度的蛋白有10個（Score>0.5），其中包括htrA、CT_790、CT_648、pbpB、CT_114、recC、CT_339、CT_017、pmpA和CT_425（圖 14），其分?jǐn)?shù)排名信息見表7。

3 討論

Ct與宿主細(xì)胞相互作用過程中，CPAF主要在感染宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中被檢測到，這與亞細(xì)胞定位顯示該蛋白集中分布在細(xì)胞質(zhì)的結(jié)論相符。多項研究［12-13］表明，CPAF對Ct致病機(jī)理有潛在的重要作用，具有多種逃逸宿主免疫反應(yīng)的新機(jī)制來促進(jìn)Ct的存活并且迅速進(jìn)入宿主細(xì)胞的胞漿，但該機(jī)制仍然是個未知數(shù)。本研究預(yù)測CPAF蛋白N端含有一個分泌的信號肽。信號肽的主要功能是指導(dǎo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸，這與Chen等［14］報道的CPAF是依賴于前導(dǎo)信號肽提供SecB來實現(xiàn)穿過內(nèi)膜的運(yùn)輸功能相一致。以往研究［15］也表明，CPAF是Ct的主要毒力因子，能夠在哺乳動物體外分裂出一組特定的衣原體蛋白，有助于調(diào)節(jié)一系列細(xì)菌和宿主的細(xì)胞功能。因此，近年來研究CPAF蛋白在細(xì)胞感染變量模型中作用的報道成為當(dāng)今的熱點(diǎn)［16］。本研究對理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CPAF是不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，半衰期為30 h，這與CPAF即使發(fā)生分子間二聚化、催化或切割殘基發(fā)生突變，但仍能產(chǎn)生活性CPAF耐受更多突變的特性相關(guān)。只有通過同時突變分子間二聚化和催化殘基，CPAF才會在感染期間完全失活，表明了關(guān)鍵殘基的重要性和CPAF蛋白對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境突變的耐受極限，提示需進(jìn)一步分析CPAF蛋白的基本結(jié)構(gòu)。CPAF蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其肽鏈上的無規(guī)則卷曲和α-螺旋水平最高，說明該蛋白具有較好的可塑性，易于形成配體和受體結(jié)合的部位，有利于衣原體疫苗的設(shè)計。近年來也有研究［17-18］表明，借助生物信息學(xué)推動衣原體疫苗研發(fā)的方法具有可行、高效、低成本的優(yōu)勢。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是通過改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)包括疏水性、可溶性和表面特性從而改變蛋白質(zhì)的功能［19］，這些都可能會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、底物、輔助因子以及與其他分子的相互作用。對CPAF蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其存在1個糖基化位點(diǎn)和多個磷酸化位點(diǎn)，推測該蛋白存在不同的修飾表型。CPAF蛋白總共存在53個可能的磷酸化位點(diǎn)，其中數(shù)量最多的是絲氨酸（Serine）磷酸化位點(diǎn)，推測是Ct和有毒物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，可為新藥或抑制劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)，同時該蛋白可能通過糖基化、磷酸化而發(fā)揮多種重要的生物學(xué)作用，還有待于以后試驗驗證。對CPAF蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于CPAF超家族，其結(jié)構(gòu)域位于第3～586位氨基酸序列上，推測該蛋白功能區(qū)域可能位于3～586氨基酸序列上。Maksimchuk等［20］以往研究報道，CPAF的N端106～212位氨基酸是一個類似宿主PDZ的保守結(jié)構(gòu)域，與人類含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相似性。這種序列保守性表明，該蛋白在Ct感染和免疫識別中起著重要作用，推測其可能在參與破壞上皮細(xì)胞連接以促進(jìn)Ct感染中至關(guān)重要。

與CPAF相關(guān)的蛋白有htrA、CT_790、CT_648、pbpB、CT_114、recC、CT_339、CT_017、pmpA和CT_425，其中htrA被報道在致病性衣原體中發(fā)揮溶解蛋白和分子伴侶的功能，被視為潛在的藥物靶點(diǎn)，還可能成為輸卵管因素不孕的生物標(biāo)志物［21-22］；pmpA屬于衣原體表面的膜結(jié)合蛋白家族成員，不僅被發(fā)現(xiàn)對衣原體感染的初始階段非常重要，而且有助于引發(fā)Th1介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，成為候選疫苗的重要蛋白［23］。本文對上述CPAF的互作蛋白的預(yù)測，將有助于揭示以CPAF蛋白為核心的信號通路。

B細(xì)胞又稱B淋巴細(xì)胞，在抗原刺激下產(chǎn)生保護(hù)性抗體參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。T細(xì)胞分為兩個功能不同的亞群：CD4+T輔助細(xì)胞（Th）和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），數(shù)量充足的CD4+和CD8+T細(xì)胞活化對清除病原體感染至關(guān)重要。所以，尋找Ct中能夠激活免疫細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位對疫苗研究具有重要意義。本文使用ABCpred服務(wù)器篩選出5個可能性最大的B細(xì)胞表位；利用ElliPro服務(wù)器發(fā)現(xiàn)了4個Score最高的B細(xì)胞表位構(gòu)象。按照中國人群人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因型分布頻率，使用SYFPEITHI網(wǎng)站預(yù)測得到多個潛在的CD8+和CD4+T細(xì)胞表位，還證實可能存在23個抗原決定簇表位。采用VaxiJen2.0和ANTIGENpro進(jìn)一步評估了CPAF蛋白的抗原性，還使用AllerTOP v2.0和Allergen FP v1.0分別對其過敏性進(jìn)行預(yù)測，證實該蛋白為非過敏原性。本研究發(fā)現(xiàn)了14個配體結(jié)合位點(diǎn)，其中黑色區(qū)域是口袋和實際配體結(jié)合最有可能的區(qū)域；虛擬篩選出5種潛在的小分子藥物，分別是伊馬替尼（Imatinib）、氟前列醇（Fluprostenol）、奈法唑酮（Nefazodone）、曲沃前列素（Travoprost）和拉坦前列素（Latanoprost）。人類被Ct感染后，臨床治療采取如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)脂類和喹諾酮類等藥物［24-26］和中藥治療［27］。不過，要根除衣原體慢性感染很困難，大多數(shù)抗生素是通過抑制蛋白質(zhì)或核酸合成來靶向代謝活躍的衣原體網(wǎng)狀體，而對代謝失活的衣原體網(wǎng)狀體卻沒有任何影響［28］。我們不得不要考慮新的化合物作為抗菌活性的方法，例如，從生物材料和植物化學(xué)物中提取的化合物包括黃酮、萜類、生物堿和部分油劑，其中許多化合物具有抗菌特性［29］。

生殖道Ct感染是最常見的性傳播疾病之一，未經(jīng)治療的Ct感染可上升至上生殖道，并且形成慢性感染，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，增加人們的健康負(fù)擔(dān)?？傊?，我們迫切需要一種安全有效的預(yù)防性疫苗來減少衣原體疾病的傳播。本文將為促進(jìn)Ct疫苗和小分子藥物的研發(fā)提供理論參考。

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