仁青常覺對胃動(dòng)力低下大鼠胃殘留率、5-HT 以及c-kit 表達(dá)的影響*

羅布占堆 達(dá)瓦卓瑪 任海龍 卓瑪東智 謝紅軍 潘永越

（西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

胃腸動(dòng)力障礙（DGIM），是當(dāng)下胃腸疾病的主要緣由［1］。胃腸動(dòng)力障礙常常表現(xiàn)為食少飽脹、消化不良等，其主要是由胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)障礙導(dǎo)致的。由于運(yùn)動(dòng)電位主頻以及平均振幅的改變，導(dǎo)致了神經(jīng)支配調(diào)節(jié)障礙［2］。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DGIM患者占據(jù)了胃腸科病患的50%，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)支出等，因此對DGIM 的治療是目前臨床研究的重點(diǎn)［3］。

然而，西藥的長期使用常常導(dǎo)致停藥后的反復(fù)發(fā)生，誘導(dǎo)的不良反應(yīng)使得臨床效果受限。傳統(tǒng)醫(yī)藥較少的毒副作用完全符合了DGIM 的病癥遷延及持續(xù)發(fā)作的特征，因此重新被人們所重視［4］。先前的研究認(rèn)為，半夏厚樸湯加減可改善DGIM 的胃腸道及其肺功能［5］等。而香砂平胃湯也可作為DGIM 治療的手段［6］。

仁青常覺是藏區(qū)廣泛使用的，用于治療各種疾病的復(fù)方。其主要特征是基于多種稀有藏藥混合而成，并且還有多種微量金屬元素［7,8］，而其對DGIM 的作用尚未得到全面驗(yàn)證。因此，本研究的目的是調(diào)查仁青常覺對甘草誘導(dǎo)的胃動(dòng)力不足大鼠的平滑肌的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 仁青常覺的活性成分石油醚提取

根據(jù)先前的研究，筆者采用了仁青常覺（西藏甘露藏藥股份有限公司，國字藥準(zhǔn)字Z54020057）的石油醚提取物作為本研究的方法［9］。提取過程如下：取仁青常覺研細(xì)后的細(xì)粉，加入體積重量比為6 倍的石油醚沸騰提取3 次，每次1 小時(shí)，40℃～50℃減壓回收石油醚，得到仁青常覺石油醚提取物。

1.2 胃動(dòng)力低下模型的建立

胃動(dòng)力低下模型的建立是在稅典奎等人的研究所進(jìn)行［3］。即采用制備的甘草（安徽井泉集團(tuán)中藥飲片有限公司，批號(hào)：20090301）煎劑對SD 大鼠進(jìn)行灌胃處理，每只10g/kg，持續(xù)5 天。

將模型大鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組，陽性組，低劑量組，中劑量組，高劑量組。對照組為0.9%生理鹽水+10g/kg 甘草煎劑；陽性組為10g/kg 甘草煎劑+0.4mg/mL 西沙比利；低（0.1g/kg）、中（0.2g/kg）、高（0.4g/kg）劑量組［10］為不同濃度的仁青常覺提取+10g/kg 甘草煎劑，持續(xù)5 天。

1.3 胃殘留率檢測

第5 次給藥后，大鼠禁食不禁水12h，隨后0.002 g/mL 苯酚紅溶液灌胃進(jìn)行胃殘留率測定。灌胃20min 后，大鼠安樂死，摘取胃。0.002g/mL 苯酚紅溶液按1:10 加入0.1mol/L 的 NaOH 溶液，隨后采用按1:5比率溶解于純水中，測定溶液560nm下吸光度，并作為標(biāo)準(zhǔn)液。隨后將胃浸入0.1mol/L 的 NaOH 溶液，充分洗滌，收集上清液，同樣的比率溶于純水中，測定OD560nm 吸光度，記錄為測定液。胃殘留率（%）=測定液 OD 值/標(biāo)準(zhǔn)液 OD 值×100%.

1.4 免疫組化檢測c-kit 以及5-HT 的表達(dá)

將獲得的胃組織石蠟包埋，切片。隨后經(jīng)過脫蠟水化，自來水清洗，PBS 清洗，檸檬酸鈉修復(fù)，H2O2以及血清封閉等。5-HT（Abcam，1:1000），c-kit（Abcam，1:4000）抗體孵育。隨后SP-9001 兔SP 試劑盒（中杉金橋）中生物素化以及HPR 標(biāo)記的抗體孵育，DAB（中杉金橋）顯色。復(fù)染，脫水，透明后封片，顯微鏡下觀察拍片。Image J pro 軟件分析相對表達(dá)量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 仁青常覺石油醚提取物對為殘留率的影響

胃殘留率是胃腸動(dòng)力障礙的指標(biāo)之一，圖1 及表1 的結(jié)果說明，在胃動(dòng)力低下的對照組中，胃排空受到抑制，殘留率達(dá)到了72.89%.西沙比利顯著的促進(jìn)了胃排空，胃殘留率下調(diào)為49.60%.仁青常覺對胃殘留率有一定的抑制作用，然而與對照組相比較，只有高劑量的仁青常覺（0.4g/kg）起到了顯著的作用（p=0.008），而低劑量（0.1g/kg）和中劑量（0.2g/kg）的仁青常覺未能發(fā)揮顯著的作用，p 值分別為0.974以及0.098。這一結(jié)果提示我們，在后續(xù)仁青常覺的劑量有待做一步的提高及細(xì)胞毒性的研究。

圖1 各組大鼠胃殘留率的變化（%）（n=3）

表1 各組大鼠的胃殘留率（%）（n=3）

2.2 仁青常覺石油醚提取物對5-HT 表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證仁青常覺石油醚提取物對胃腸動(dòng)力障礙的作用機(jī)制。我們對胃體、胃底組織進(jìn)行了5-HT含量檢測。在對照組中，5-HT 相對表達(dá)很少，說明甘草對胃底，胃體中5-HT 的釋放有一定的抑制作用，這與先前的研究結(jié)果是一致的［3］。而陽性組不論是胃底還是胃體，5-HT 水平大幅提高，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中高劑量的仁青常覺對5-HT 的釋放具有促進(jìn)作用明顯（p ＜0.01）；劑量組胃體中5-HT 與對照組比較的p 值0.257，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而胃底與對照組的比較p 值小于0.05，差異顯著。

圖2 胃體及胃底中5-HT 的相對表達(dá)量（n=3）

2.3 仁青常覺石油醚提取物對c-kit 表達(dá)的影響

c-kit 的表達(dá)、突變與胃腸平滑肌功能紊亂及間質(zhì)腫瘤發(fā)生的相關(guān)性已被證明［11］。因此，在本研究中，筆者檢測了胃底、胃體中c-kit 的表達(dá)，以驗(yàn)證仁青常覺是否能夠通過調(diào)節(jié)c-kit 的含量，影響胃腸平滑肌的功能。在對照組中，可以看到肌間神經(jīng)叢周圍的c-kit 含量較少，而陽性組中可明顯看到大量棕黃色c-kit 的存在。在仁青常覺低劑量組中，c-kit 的表達(dá)與對照組相近，而0.2g/kg 以及0.4g、kg 的仁青常覺顯著的促進(jìn)了c-kit 的表達(dá)，高劑量的c-kit 表達(dá)略高于陽性組，p 值分別為0.657（胃底），0.172（胃體）。

3 討論

仁青常覺作為一種為數(shù)不多的復(fù)方藏藥，主要成分包含珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、訶子、牛黃、人工麝香、西紅花等。在《四部醫(yī)典》中被記錄為“強(qiáng)身健體，增強(qiáng)免疫力”等，在臨床上對治療、干預(yù)胃腸炎、胃潰瘍、宮頸癌、哮喘等有獨(dú)特療效且臨床安全評價(jià)較好［12-16］。

表2 5-HT 在各組大鼠中的相對表達(dá)量（n=3）

圖3 c-kit 在各組大鼠胃底、胃體中的相對表達(dá)量（n=3）

研究認(rèn)為，SCF/c-kit 信號(hào)通路的上調(diào)是胃腸動(dòng)力改善的機(jī)制之一［17,18］。而Cajal 間質(zhì)細(xì)胞的鈣庫受體蛋白IP3R，Ry R 以及PLC 表達(dá)的上調(diào)被認(rèn)為介導(dǎo)了C-kit表達(dá)的增加［19］。肌間神經(jīng)叢中5-羥色胺（5-HT）是調(diào)節(jié)胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的因子，5-HT 的缺陷可導(dǎo)致大腦以及胃腸道功能障礙。而5-HT 的含量的變化也是5-HT APUD 細(xì)胞數(shù)的一個(gè)體現(xiàn)［20］。5-HT APUD細(xì)胞數(shù)目的減少，導(dǎo)致了5-HT 分泌的減少，胃平滑肌的運(yùn)動(dòng)功能減弱。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)仁青常覺顯著了增加了胃動(dòng)力低下大鼠胃底、胃體中c-kit 以及5-HT 的表達(dá)，并且胃排空能力也得到改善。因此，我們初步認(rèn)為仁青常覺可通過上調(diào)c-kit 以及5-HT 的水平提高平滑肌動(dòng)力，從而緩解胃動(dòng)力不足的癥狀。

表3 c-kit 在胃體、胃底中的相對表達(dá)量（n=3）

值得注意的是，DGIM的發(fā)生也常常合并其他疾病，例如肺心病加重期合并DGIM［5］，糖尿病合并DGIM［21］等，針對胃腸動(dòng)力障礙的單純治療已經(jīng)不能夠滿足現(xiàn)下患者的需求。因此，對DGIM 的臨床治療提出了新的挑戰(zhàn)，我們需要更多的研究來滿足現(xiàn)下的需求。