滸苔和石莼對模擬酸雨脅迫的生理生化響應

杜 響 陳海敏 秦 欣 許萬濤 駱其君

（寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315832）

酸雨作為一個全球性的環(huán)境問題，近幾十年隨著化石燃料的使用而變得愈加嚴重［1-2］。同歐洲和北美一樣，由于化石燃料大量消耗，我國已成為世界上受酸雨影響的重災區(qū)之一［3］。在我國南方，最易受酸雨影響的地區(qū)遭受了pH＜5的酸雨污染［4-5］。特別是浙江省寧波和金華市曾受到大量酸雨入侵，雨水pH值分別低于4.74和4.12，尤其是象山縣，2021年雨水的pH值達到了3.98［6］。酸雨可直接破壞植物細胞膜，使植物的代謝功能受到抑制，進而影響植物形態(tài)結構［7］。

生活在潮間帶的大型海藻，由于潮汐的每日漲落，周期性的在漲潮時淹沒在海水中，在退潮時暴露在空氣中。當潮間帶大型海藻于低潮期暴露在空氣中時，經(jīng)常會直接遭受pH 值為3.24～6.56 的酸雨脅迫，而且酸雨脅迫往往持續(xù)數(shù)小時［8］。研究表明，模擬酸雨不僅導致冬青細胞膜透性增加［9］、茶樹（Camellia sinensis）幼苗葉綠素a和類胡蘿卜素含量減少［10］，而且使夏枯草（Prunella vulgaris）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢［11］；pH值4和5的模擬酸雨處理會使壇紫菜（Neoporphyra haitanensis）光合作用和呼吸作用速率下降，導致壇紫菜葉狀體的死亡［12］；pH值4.4的模擬酸雨顯著抑制了裂片石莼（Ulva fasciata）的最大光化學量子產(chǎn)量（maximal photochemical quantum yield of PSⅡ，F(xiàn)v/Fm）、暗呼吸及光合放氧速率［13］。短期酸雨引起的低pH值海水導致大型海藻種類減少，進而導致珊瑚藻屬（Corallina）物種泛濫［8］；頻發(fā)的酸雨甚至可能是馬尾藻床衰退的原因之一［14］。可見，酸雨對海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了不可忽略的影響。

經(jīng)典的綠藻是按照形態(tài)、結構進行分類，滸苔為單層細胞組成的細長中空管狀，如滸苔（Enteromorpha prolifera）、腸滸苔（E.intestinalis）；石莼為雙層細胞組成的片狀，如石莼（Ulva lactuca）、蠣菜（U.conglobata）［15］。在中國海藻志中也采用該分類及命名［16］。Hayden等［17］依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹中Enteromorpha與Ulva相互交叉分布，而合并為一屬Ulva。酸雨脅迫對潮間帶大型海藻形態(tài)變化、生理特性及存活影響等的研究鮮見報道。且與紅藻、褐藻相比，近海綠藻的種類及生物量在逐漸增加，且更為常見。因此，本研究以潮間帶常見綠藻為試驗材料，研究不同pH值的模擬酸雨對潮間帶常見綠藻光合作用的影響，同時測定其光合色素、可溶性蛋白和可溶性糖含量及抗氧化酶活性，探討潮間帶常見綠藻對酸雨的生理生化響應，以期為研究潮間帶大型海藻受環(huán)境脅迫的影響及其群落變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

滸苔（E.prolifera）、石莼（U.lactuca）、長石莼（U.stenophylla）、蠣菜（U.conglobata）于2021 年2 月至2022年5月采自浙江省東極島（122.6°E，30.1°N）與南麂列島（121.3°E，27.3°N）。采回實驗室后，選取大小和形態(tài)較一致的藻體，用滅菌海水反復沖洗，去除附生雜藻，在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 °C，光照強度為100 μmol·m-2·s-1，光照周期為12 h 光照/12 h黑暗。每日更換培養(yǎng)海水。

1.2 試驗儀器

GXZ 型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；WATER-PAM 葉綠素熒光儀，德國Walz 公司；Nikon Eclipse Ti 倒置熒光顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；3001 酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；1-16K離心機，德國Sigma公司；PHS-3E型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；FiveEasy Plus FE38 電導率儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗設計

根據(jù)浙江省自然降雨記錄［18］，將硫酸與硝酸按體積比配制成母液，并用蒸餾水將母液稀釋成酸性水溶液，得到pH 值分別為6.3、5.6、4.5、4.0 和3.5 的模擬酸雨［19］。

選擇狀態(tài)良好的綠藻，用濾紙吸干表面水分后，放入綠藻與模擬酸雨質(zhì)量比為1∶100 的培養(yǎng)皿中分別處理5、15、30、60、120、240、360 min。以自然海水（鹽度25，pH 值8.1）作為對照，試驗設置3 組重復，培養(yǎng)溫度為20 °C，光照強度為100 μmol·m-2·s-1。

根據(jù)葉綠素熒光參數(shù)及形態(tài)觀察的結果，選擇pH值4.5 的模擬酸雨脅迫進行滸苔與石莼的可溶性蛋白、可溶性糖含量及抗氧化酶活性等生理響應試驗。

1.4 生理生化指標測定及形態(tài)觀察

1.4.1 葉綠素熒光參數(shù)測定 暗處理15 min后，使用WATER-PAM 葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光誘導曲線，記錄光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ，PS Ⅱ）的Fv/Fm值。

1.4.2 相對電導率、質(zhì)壁分離率測定及形態(tài)學觀察利用Nikon Eclipse Ti 倒置熒光顯微鏡觀察模擬酸雨處理后綠藻細胞形態(tài)變化并拍照；參照郝再彬等［20］的方法，用FiveEasy Plus FE38電導率儀測定電導率。

1.4.3 色素的提取及測定 參考Moran 等［21］的方法并稍作改進。稱取模擬酸雨處理后的藻體0.1 g（鮮重）用10 mL 無水甲醇4 ℃萃取24 h，提取液5 000 r·min-1離心10 min后，取上清于酶標儀上進行檢測，參比液為提取劑空白溶液。根據(jù)公式（1）［22］、公式（2）［23］計算葉綠素a（chlorophylla，Chla）與類胡蘿卜素（carotenoids，Car）的含量。

式中，A750、A665、A652、A510、A480分別為波長750、665、652、510、480 nm 處的吸光度，最后根據(jù)藻體及甲醇的用量計算出Chla與Car的含量（mg·g-1）。

1.4.4 可溶性蛋白和可溶性糖含量的測定 可溶性蛋白和可溶性糖含量分別采用南京建成生物工程研究所蛋白檢測試劑盒（A045-2）考馬斯亮藍法、植物可溶性糖檢測試劑盒蒽酮比色法測定［24］。

1.4.5 抗氧化酶活性的測定 抗氧化酶活性均采用生物試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。其中，SOD 活性利用A001-3-2 總超氧化物歧化酶測定試劑盒進行測定；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性利用A084-3-1過氧化物酶測定試劑盒進行測定；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性利用A-007-1-1 過氧化氫酶測定試劑盒進行測定［25］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2019 整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 26.0 軟件進行單因素ANOVA 分析，采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 綠藻葉綠素熒光參數(shù)對不同pH 值模擬酸雨的響應

由圖1 可知，隨著模擬酸雨pH 值降低及處理時間延長，4 種綠藻Fv/Fm總體均呈下降趨勢。與對照組相比，pH 值6.3、pH 值5.6 的模擬酸雨處理4 種綠藻，僅pH 值5.6 的模擬酸雨處理長石莼6 h 及處理滸苔4 h有極顯著差異（P＜0.01），其余均無顯著差異（P＞0.05）；pH值3.5的模擬酸雨處理1 h，石莼＞長石莼，其余綠藻Fv/Fm幾乎趨近于0。

圖1 不同pH值的模擬酸雨對4種綠藻Fv /Fm的影響Fig.1 Effects of simulated acid rain at different pH on Fv /Fm of four species of green seaweeds

由圖2可知，pH 值4.5的模擬酸雨處理過程中，石莼相較于其他綠藻表現(xiàn)出良好的耐酸性，但滸苔和長石莼間無顯著差異（P＞0.05）。酸雨處理6 h，石莼、蠣菜、長石莼、滸苔的Fv/Fm依次為0.556、0.471、0.321、0.285，其中，滸苔和蠣菜、石莼間均具有極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 pH值4.5的模擬酸雨對4種綠藻Fv /Fm的影響Fig.2 Effects of simulated acid rain at pH 4.5 on Fv /Fm of four species of green seaweeds

2.2 綠藻相對電導率、質(zhì)壁分離率及藻體形態(tài)對不同pH值的模擬酸雨的響應

滸苔相對電導率與酸度呈正相關，pH 值越低其相對電導率越大，且相對電導率隨著脅迫時間的增加而變大。不同pH值的模擬酸雨處理滸苔，其相對電導率均高于對照組，pH 值3.5 的模擬酸雨處理6 h 的相對電導率最大，為98.3%，和對照組相比差異極顯著（P＜0.01）（圖3-A）。經(jīng)過pH 值4.5 的模擬酸雨不同時間處理，與對照組（圖3-B）相比，滸苔細胞發(fā)生不同程度的質(zhì)壁分離，酸雨處理2 h，有60%細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，6 h 時，幾乎所有細胞發(fā)生質(zhì)壁分離（圖3-B～F）；對石莼而言，酸雨處理6 h，僅有50%的細胞發(fā)生了質(zhì)壁分離（圖3-G～I）；模擬酸雨相同處理時間下，滸苔質(zhì)壁分離率大于石莼。由圖3-J～L 可知，在酸雨處理過程中，石莼細胞不僅發(fā)生質(zhì)壁分離，而且雙層細胞緊密排列的藻體會形成囊泡狀突起，進而使藻體由雙層細胞分裂成單層，此時其Fv/Fm趨近于0。

圖3 模擬酸雨對滸苔、石莼細胞膜透性、質(zhì)壁分離率及藻體形態(tài)的影響Fig.3 Effects of simulated acid rain on cell membrane permeability，plasma wall separation rate and seaweeds morphology of E.prolifera and U.lactuca

考慮到數(shù)據(jù)采集及試驗時間的延續(xù)，本研究認為采用pH 值4.5 的模擬酸雨作為脅迫方法較為合理。因此后續(xù)試驗中，在不同處理時間條件下，研究4種綠藻在pH值4.5的模擬酸雨脅迫下的生理響應。

2.3 綠藻色素含量對pH 值4.5 的模擬酸雨脅迫的響應

pH 值4.5的模擬酸雨對4種綠藻色素的影響與處理時間有關，與對照組相比，酸雨處理降低了綠藻的色素含量。6 h 時，對葉綠素a含量而言，石莼＞長石莼＞滸苔＞蠣菜，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）（表1）。由表2 可知，酸雨處理6 h，除長石莼外，其余綠藻Car含量與滸苔并無顯著差異（P＞0.05），與對照組相比，長石莼的Car降幅依次小于蠣菜、石莼、滸苔。

表1 葉綠素a含量對pH值4.5的模擬酸雨脅迫的響應Table 1 Response of chlorophyll a content to simulated acid rain stress at pH 4.5 /（mg·g-1）

表2 類胡蘿卜素含量對pH值4.5的模擬酸雨脅迫的響應Table 2 Response of carotenoids content to simulated acid rain stress at pH 4.5 /（mg·g-1）

2.4 綠藻可溶性蛋白含量和可溶性糖含量對pH 值4.5的模擬酸雨脅迫的響應

由圖4可知，與對照組相比，pH 值4.5的模擬酸雨處理2 h 顯著增加了4 種綠藻的可溶性蛋白含量（P＜0.05）。在6 h時，各綠藻的可溶性蛋白含量達到最大，石莼、長石莼、蠣菜、滸苔含量分別增加了1.46、2.48、1.58、1.56 倍，可溶性蛋白含量表現(xiàn)為石莼＞蠣菜＞長石莼＞滸苔；隨著酸雨處理時間的延長，綠藻的可溶性糖含量總體下降，6 h 時，分別降到對照組的54.46%、60.78%、69.56%、55.19%，且石莼、長石莼、蠣菜的可溶性糖含量是滸苔的3.50、3.66、4.37 倍，石莼、長石莼、蠣菜均與滸苔之間差異顯著（P＜0.05）。

圖4 可溶性蛋白含量和可溶性糖含量對pH值4.5的模擬酸雨脅迫的響應Fig.4 Response of soluble protein content and soluble sugar content to simulated acid rain stress at pH value 4.5

2.5 綠藻抗氧化酶活性對pH 值4.5的模擬酸雨脅迫的響應

由圖5可知，在處理時間為6 h時，pH值4.5的模擬酸雨處理降低了4種綠藻SOD活性，石莼、長石莼、蠣菜和滸苔的SOD活性較對照分別下降了60.09%、65.74%、68.85%、66.02%（均為P＜0.05），SOD 活性表現(xiàn)為石莼＞滸苔＞長石莼＞蠣菜；與SOD 活性變化趨勢相反，酸雨提高了4 種綠藻POD 活性，且隨著處理時間的增加而增加，與對照組相比，6 h時，石莼、長石莼、蠣菜和滸苔POD活性增至36.08、32.93、31.94、31.16 U·mg-1·prot-1，且與對照間差異顯著（P＜0.05），并且石莼與滸苔之間差異顯著（P＜0.05）；4 種綠藻CAT 活性與酸雨處理時間呈負相關，6 h 時，石莼、長石莼、蠣菜和滸苔CAT活性分別下降至對照組的48.21%、48.86%、57.52%、32.57%，此時，滸苔 CAT 活性僅為石莼的69.81%、長石莼的69.26%、蠣菜的71.25%，滸苔分別與石莼、長石莼、蠣菜之間差異顯著（P＜0.05）。

圖5 抗氧化酶活性對pH值4.5的模擬酸雨脅迫的響應Fig.5 Response of antioxidant enzyme activity to simulated acid rain stress at pH value 4.5

3 討論

研究表明，葉綠素熒光檢測可以作為一種快速、無損的檢測植物非生物和生物脅迫的方法［26-28］。最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）作為熒光分析中常用的光合參數(shù)，代表了光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）的光化學效率，可以反映植物在逆境中受脅迫的情況［29］。在本研究中，滸苔、石莼等潮間帶常見綠藻在模擬酸雨的脅迫下，隨著酸雨pH 值的減小和處理時間的延長，其Fv/Fm總體均呈下降趨勢，這與前人研究結果一致［19］。與對照組相比，pH值6.3的模擬酸雨處理下藻體Fv/Fm無明顯差異，但其余pH 值的模擬酸雨處理下Fv/Fm則存在顯著差異，說明輕度酸雨（pH 值5.6）對綠藻的光合作用未產(chǎn)生顯著影響，而中度酸雨（pH 值4.5）和重度酸雨（pH 值4.0、3.5）均產(chǎn)生顯著影響。在模擬酸雨脅迫下，隨著酸度增加和處理時間延長，滸苔細胞相對電導率顯著升高。特別是pH值4.0和3.5的模擬酸雨處理5 min 后其相對電導率升高達到顯著水平（P＜0.05），說明重度酸雨脅迫對滸苔的細胞膜系統(tǒng)損害非常嚴重，可能會影響光合系統(tǒng)的電子傳遞效率，抑制其光合作用。與Fv/Fm類似，試驗藻體葉綠素a及類胡蘿卜素含量也隨處理時間的延長而下降，與前人研究結果一致［30-31］?？赡苁怯捎谌~綠素降解基因上調(diào)，導致葉綠素含量降低，從而迫使藻類的光合作用下降［32］。說明酸雨從根本上阻礙了植物賴以生存的光合作用。此外，在酸雨脅迫下，葉綠體結構和類囊體可能被破壞，阻礙了藻類的光合運輸，最終抑制藻類的光合作用［33-34］。根據(jù)不同pH 值的模擬酸雨條件下綠藻Fv/Fm及細胞滲透性測定結果，本研究認為采用pH 值4.5 的模擬酸雨作為脅迫方法較為合理。

酸雨對植物的影響機理在于其使植物膜透性增加，自由基代謝平衡失調(diào)，進而導致生物膜系統(tǒng)受損，以及膜保護酶活性和膜保護物質(zhì)含量降低［35］?？扇苄蕴?、可溶性蛋白作為植物細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維持細胞滲透壓、穩(wěn)定生物大分子的結構和功能起重要作用［36］。一定程度上可溶性糖又具有保護植物細胞膜、原生質(zhì)體以及酶類的功能。研究發(fā)現(xiàn)，與正常情況相比，模擬酸雨處理植物中的POD 活性及可溶性蛋白含量顯著增加［37-38］。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間的增加，模擬酸雨提高了綠藻可溶性蛋白的含量及POD 活性，這在一定程度上對綠藻應對酸雨脅迫有利，而本研究中可溶性糖含量和SOD、CAT活性在酸雨條件下出現(xiàn)下降的趨勢，表明酸雨脅迫顯著抑制了綠藻的可溶性糖含量和SOD、CAT活性，這可能是由于酸雨使植物葉片細胞內(nèi)環(huán)境pH 值和原生質(zhì)等電點降低，從而使酶活性偏離最適pH 值，同時改變了酶的帶電性質(zhì)和底物電離狀況或破壞了酶結構，使酶活性鈍化［35］。進而對滸苔、石莼等綠藻產(chǎn)生了不良影響。

生理特性作為植物固有屬性，在一定程度上既反映出海藻在酸雨脅迫下的基因表達水平變化，也體現(xiàn)出其形態(tài)特征的改變［39］。自然界進化史表明親緣關系越近的海藻其生理特性越相似。然而本研究發(fā)現(xiàn)，隨著模擬酸雨pH值的降低及處理時間延長，滸苔與石莼生理差異愈加明顯，并且石莼相較于滸苔受酸雨影響較小，一定程度上表明石莼對酸雨的耐受性大于滸苔。本研究結果支持“滸苔與石莼為兩種不同的屬”這一結論［16］。然而以內(nèi)轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）序列和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亞基（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL）基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果顯示，滸苔和石莼相互交錯分布，因此有學者認為二者應該同屬于石莼［17，40］?？赡苁怯捎谑淮蠖酁殡p層細胞組成的膜狀體，藻體相對短而厚，細胞壁比滸苔發(fā)達，有利于抵抗酸雨的侵蝕；而滸苔為單層細胞組成的中空管狀體，藻體相對長而薄，對酸雨耐受性較石莼弱。此外，當滸苔、石莼歷經(jīng)干出到酸雨脅迫時，其干出復水性能以及滸苔、石莼分布的區(qū)域生態(tài)可能也是導致滸苔比石莼耐酸性弱的原因之一，具體原因還需進一步試驗論證。本研究表明，模擬酸雨脅迫下，石莼、蠣菜與長石莼之間同樣存在差異，這可能是由于石莼、蠣菜多分布在潮間帶的高中潮帶，較長時期暴露在光溫等環(huán)境劇烈變化的條件下，細胞壁厚，對于酸雨的響應表現(xiàn)為較強的耐受性；而長石莼分布在低潮帶的石沼或淺海中，藻體較薄，對于酸雨的響應與石莼、蠣菜有差別，耐受性較差。頻繁的酸雨會導致水體酸化，甚至可能導致潮間帶生態(tài)系統(tǒng)結構以及功能的紊亂。酸雨脅迫下植物的光合作用和生長會受到影響，長此以往勢必導致生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的衰退［41］。當酸雨脅迫潮間帶海藻時，鹽脅迫、干旱脅迫等也常常伴隨著潮漲潮落襲擊著潮間帶海藻，對于多重脅迫下潮間帶海藻生理特性及群落變化還需進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，和對照組相比，pH 值4.0 和pH值3.5 的模擬酸雨抑制了4 種綠藻的Fv/Fm，但pH 值6.3 的模擬酸雨處理下4 種綠藻Fv/Fm無明顯差異；綠藻相對電導率及質(zhì)壁分離率也隨著模擬酸雨pH 值的降低及處理時間延長而逐漸上升。其中，pH 值6.3 和pH 值5.6 的模擬酸雨處理2 h 滸苔相對電導率產(chǎn)生顯著差異，但pH 值4.0 和pH 值3.5 的模擬酸雨僅處理5 min 便達到極顯著水平。說明采用pH 值4.5 的模擬酸雨作為脅迫方法探討不同處理時間條件下海藻的響應機制較為合理。pH 值4.5 的模擬酸雨提高了綠藻可溶性蛋白含量及POD 活性，但降低了色素含量、可溶性糖含量和SOD、CAT活性，且隨時間延長降低幅度愈加明顯。此外，3 種石莼對模擬酸雨的耐受性均高于滸苔。

致謝：感謝云南省微藻重點實驗室工作人員對本研究提供的幫助！