復(fù)合誘變選育高產(chǎn)赤蘚糖醇解脂亞羅酵母及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉芳美 夏 凱 彭艷婷 趙學(xué)群 沙如意 黃 俊

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023）

目前，因糖過量攝入造成的健康問題給人們的生活造成了困擾［1-2］。而甜味劑的發(fā)現(xiàn)和使用有助于降低食品中糖的添加量，從而減少了糖的攝入。近年來，作為天然甜味劑的赤蘚糖醇（erythritol）憑借獨(dú)特的理化性質(zhì)，如熱值低、基本不被人體代謝、穩(wěn)定性高和食用不會引起腸道不適等受到廣泛關(guān)注［3］。赤蘚糖醇化學(xué)名為（2R，3S）-butane-1，2，3，4-丁四醇，是一種白色、無味、不吸濕、無光學(xué)活性、熱穩(wěn)定性好且易溶于水的四碳醇，廣泛存在于水果、蔬菜和發(fā)酵食品中。目前，赤蘚糖醇已被廣泛用于食品、醫(yī)藥和化工產(chǎn)品中，市場需求量急劇上升，這對赤蘚糖醇的生產(chǎn)提出了新的要求［4］。赤蘚糖醇可以通過化學(xué)法和微生物發(fā)酵法合成，然而化學(xué)合成法存在生產(chǎn)效率低、成本高和操作危險(xiǎn)等缺點(diǎn)［1］；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)過程溫和且容易控制，是現(xiàn)今赤蘚糖醇生產(chǎn)的主要途徑［1］。

赤蘚糖醇主要由酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)，已知的赤蘚糖醇高產(chǎn)菌種來源于假絲酵母屬（Candida）、亞羅酵母屬（Yarrowia）和圓酵母屬（Torula）等，其中被認(rèn)為是安全微生物（generally regarded as safe，GRAS）的解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）是赤蘚糖醇生產(chǎn)中使用最多的菌種［5-6］。然而，目前能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)赤蘚糖醇的工業(yè)菌種資源仍相對匱乏，已報(bào)道的不同菌種間性能差異顯著。因此，菌種選育仍然是現(xiàn)階段重要的基礎(chǔ)性工作。誘變處理是提高菌種性狀的重要途徑，針對赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株，目前采用的主要誘變方法為紫外線（ultraviolet，UV）輻射、硫酸二乙酯（diethyl sulphate，DES）和氯化鋰（LiCl）分別處理等［7-8］。相比于紫外線輻射，γ 射線誘變因便于控制輻射條件、試驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn)，已在生物育種中得到普遍應(yīng)用［9-10］。此外，常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變因操作簡單、安全性高、環(huán)境友好和突變速度快等特點(diǎn)已在生物高效進(jìn)化育種中取得了良好的效果［11-12］。然而，這兩項(xiàng)技術(shù)在赤蘚糖醇生產(chǎn)菌株的誘變選育中尚未得到推廣。

鑒于此，本研究以解脂亞羅酵母WT5 為出發(fā)菌株，采用60Co-γ 射線輻射和ARTP 復(fù)合誘變處理，旨在獲得一株高產(chǎn)赤蘚糖醇且遺傳性能穩(wěn)定的菌株，并探明復(fù)合誘變處理的最佳條件及其在解脂亞羅酵母誘變選育中的實(shí)用性及高效性。此外，通過對培養(yǎng)基組分的Plackett-Burman （PB）擬合進(jìn)行優(yōu)化以及培養(yǎng)模式做出改進(jìn)，以期進(jìn)一步提高赤蘚糖醇產(chǎn)量，為其他菌種的誘變選育以及赤蘚糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)中所用化學(xué)試劑，如無特殊說明，均為分析純，采購于生工生物工程（上海）股份有限公司以及國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（北京）。

菌種活化培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：D-葡萄糖 20 g·L-1、酵母浸出粉（Oxoid）10 g·L-1、蛋白胨（Oxoid）5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1，pH 值6.0；搖瓶種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變，葡萄糖濃度分別改為200 和330 g·L-1，用于誘變后篩選的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵培養(yǎng)基一致。其他優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分見下文所述，固體培養(yǎng)基在液體成分基礎(chǔ)上添加2% （w·v-1）瓊脂粉。

1.2 主要儀器設(shè)備

SpectraMax iD3 全波長多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司；Allegra64R 臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter 公司；KLF2000 3.7 L 全自動發(fā)酵罐，瑞士比歐生物工程公司；ZQZY-78AE 智能恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；e2695 高效液相色譜儀，美國Waters公司；ARTP-II型ARTP誘變系統(tǒng)，無錫源清天木生物科技有限公司；Aminex HPX-87H 分析柱（300 mm × 7.8 mm），美國Bio-Rad 公司；2414 示差折光檢測器；美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 γ 射線誘變處理及菌株篩選 甘油管保存菌種劃線于固體活化培養(yǎng)基，之后置于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d。挑取單菌落接種于40 mL 種子培養(yǎng)基，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600=3.0±0.5，之后5 000 r·min-1條件下室溫離心收集菌體并使用生理鹽水洗滌2 次。利用生理鹽水懸浮菌體并進(jìn)行系列稀釋，獲得每毫升細(xì)胞個數(shù)為107的菌液，之后對菌液進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理：輻射劑量為0 （空白）、400、800、1 200、1 600和2 000 Gy，試驗(yàn)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心完成。誘變完成后，稀釋菌液并涂布于含有0.005% （w·v-1）2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）的固體篩選培養(yǎng)基（TTC 氧化態(tài)為無色，在胞內(nèi)脫氫酶的作用下，TTC 作為氫受體可被還原為紅色的三苯甲臜，使菌落變紅，顏色越深脫氫酶活性越高［13］）。之后置于黑暗條件培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色變化，計(jì)算成活菌落數(shù)，并計(jì)算致死率：

致死率=［1-（誘變組菌落數(shù)/對照組菌落總數(shù)）］×100%。

挑取顏色深紅且直徑大的單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行為期7 d 的赤蘚糖醇發(fā)酵試驗(yàn)（搖瓶容積為500 mL），測定發(fā)酵液中赤蘚糖醇濃度以作為高產(chǎn)菌株篩選依據(jù)，并計(jì)算正負(fù)突變率。正向突變定義為當(dāng)突變菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量超過出發(fā)菌株5%以上且結(jié)果差異顯著，反之如產(chǎn)量降低5%以上則為負(fù)突變，其他則為中性突變。同時(shí)對獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定測試。將備選優(yōu)良菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)后以1% （v·v-1）比例接種于40 mL篩選培養(yǎng)基，進(jìn)行為期7 d 的振蕩培養(yǎng)（30 ℃、200 r·min-1），同時(shí)以上一次第2 天發(fā)酵液作為下一次轉(zhuǎn)接的種子液，連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次，每次發(fā)酵結(jié)束后測定培養(yǎng)液中赤蘚糖醇濃度。保存性狀優(yōu)良菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 ARTP 誘變處理及菌株篩選 菌種的活化和菌懸液的制備過程參照1.3.1 所述，菌懸液的制備改用無菌水，無菌條件下將載片置于酒精燈外焰灼燒30 s，待冷卻后放到已滅菌培養(yǎng)皿中，取10 μL 菌液均勻涂布于載片表面。之后進(jìn)行ARTP誘變：處理距離2 mm；處理功率100 W；氣流量8 SLM；處理時(shí)間為0、20、40、50、60、70、80 和100 s。誘變結(jié)束后將載片放至1 mL無菌生理鹽水中制備菌懸液，經(jīng)不同倍數(shù)稀釋后涂布于含TTC 的固體篩選培養(yǎng)基。ARTP 試驗(yàn)由無錫源清天木生物科技有限公司完成，高產(chǎn)菌株的篩選和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)參照1.3.1進(jìn)行。

在早教方式上，線下課程是大多數(shù)年輕父母的首選，只有31%的父母接受線上課程。線上課程里，最受歡迎的是音樂課和語言課。一線城市偏愛語言課，特別是上海，比例高達(dá)93%；五線城市最愛音樂課，整體占比為80%。

1.3.3 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn) 選取100～500 g·L-1葡萄糖（C6H12O6·H2O）、0～15 g·L-1酵母粉、0～5 g·L-1蛋白胨、0～20 g·L-1氯化鈉、0～100 mg·L-1硫酸銨、0～500 mg·L-1磷酸二氫鉀、0～100 mg·L-1維生素B1、0～50 mg·L-1肌醇六磷酸、0～400 mg·L-1司班20、0～10 mg·L-1吐溫80、0～20 mg·L-1硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0～1 mg·L-1硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、0～20 mg·L-1硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0～20 mg·L-1硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、0～20 mg·L-1硫酸錳（MnSO4·H2O）、0～20 mg·L-1氯化鈣，以及初始pH 值4～6 和裝液量20～60 mL 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組成分選擇5 個濃度梯度，每組設(shè)置3 次平行試驗(yàn)，以赤蘚糖醇濃度為指標(biāo)確認(rèn)單因素的最佳條件。用于單因素試驗(yàn)的基本培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：330 g·L-1葡萄糖、5 g·L-1酵母浸出粉、5 g·L-1氯化鈉、0.5 g·L-1磷酸二氫鉀，初始pH值6.0，裝液量40 mL，發(fā)酵周期168 h。

1.3.4 Plackett-Burman (PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件中的PB設(shè)計(jì)原理，選取葡萄糖（A）、酵母粉（B）和蛋白胨（C）等14個因素進(jìn)行三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，以確定影響顯著的因素以及最佳培養(yǎng)基組成。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels for PB test

1.3.5 赤蘚糖醇發(fā)酵試驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.5.1 搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) 挑取誘變后生長較快且顏色較深單菌落于5 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜活化培養(yǎng)，之后以5% （v·v-1）比例接種于40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行為期7 d的連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取樣測定發(fā)酵液中赤蘚糖醇濃度。

1.3.5.2 罐上分批發(fā)酵試驗(yàn)（batch fermentation，BF）挑取單菌落過夜活化培養(yǎng)，之后以5%比例轉(zhuǎn)接于30 mL種子培養(yǎng)基（250 mL 搖瓶）中，于30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，制備一級種子液，隨后以5%比例轉(zhuǎn)接于80 mL種子培養(yǎng)基（500 mL 搖瓶）中培養(yǎng)制備二級種子液，之后以10%比例轉(zhuǎn)接于2.0 L 發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵罐體積3.7 L），控制通氣量在250 NL·h-1，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，罐壓0.1 MPa，發(fā)酵周期為8 d。發(fā)酵過程中每隔24 h取樣測定赤蘚糖醇濃度、葡萄糖濃度、菌液OD600、菌體干重和pH值。

1.3.5.3 罐上兩階段pH 調(diào)控法分批發(fā)酵（two-stage batch fermentation，TSBF）種子液制備過程參照分批發(fā)酵試驗(yàn)法，上罐時(shí)第一階段控制葡萄糖初始濃度為50 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間持續(xù)48 h，之后補(bǔ)加葡萄糖濃度至243 g·L-1；pH 值控制為第一階段自然和第二階段4.0（TSBF1）、第一階段6.0和第二階段4.0 （TSBF2）。

1.3.5.4 發(fā)酵液中葡萄糖和赤蘚糖醇濃度測定 產(chǎn)物和底物濃度測定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，參照文獻(xiàn)［14］所述，檢測條件：柱溫35 ℃，上樣量10 μL，流動相為0.5 mmol·L-1硫酸，流速0.6 mL·min-1。

1.3.5.5 菌體干重測定 定時(shí)取樣5 mL 用于離心收集菌體，使用無菌去離子水洗滌菌體沉淀兩次后置于恒溫干燥箱烘干至恒重，計(jì)算菌體干重（g·L-1）。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 研究中所涉及生物學(xué)試驗(yàn)均重復(fù)3 次，每次3 組平行，數(shù)據(jù)差異顯著性分析由Origin 9.0 軟件中的ANOVA 分析方法完成［15］，選用Bonferroni 多重比較法，P＜0.05 表示兩組數(shù)據(jù)間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射選育赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株

選擇60Co-γ射線不同輻射劑量處理解脂亞羅酵母WT5。由致死率曲線可知，當(dāng)輻射劑量大于800 Gy時(shí)，細(xì)胞的致死率達(dá)90%以上，而當(dāng)輻射劑量為2 000 Gy時(shí)，細(xì)胞致死率為100% （圖1-A）。一般情況下，致死率偏低不易獲得性狀優(yōu)良菌株，而致死率過高易造成菌種性能的大幅改變。為確定最佳輻射劑量，分別挑取800、1 200 和1 600 Gy 誘變條件下共51 株菌進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，在800 Gy 輻射條件下，挑取的12 株菌中發(fā)生正突變的有3 株，負(fù)突變的有5 株，正突變率為25%（圖1-B）。此外，在1 200 Gy 輻射條件下挑取的20 株菌中，正突變菌株為10 株，正突變率為50%。然而，在1 600 Gy 輻射條件下，菌種的負(fù)突變率明顯上升，在挑取的19株菌中，發(fā)生負(fù)突變的有13株，負(fù)突變率達(dá)68.42%，而正突變率僅為15.79%。在挑取的所有突變菌株中，赤蘚糖醇最高產(chǎn)量可達(dá)40.50 g·L-1，是出發(fā)菌株WT5 （25.20 g·L-1）的1.61倍。緊接著對該突變株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測試，結(jié)果顯示在連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次后，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量仍然穩(wěn)定（圖1-C）。綜上可知，60Co-γ 射線輻射劑量在1 200 Gy 左右時(shí)較為適宜，并通過輻射誘變成功獲得了赤蘚糖醇產(chǎn)量明顯提升的優(yōu)良菌株，將其命名為解脂亞羅酵母WC18。

2.2 ARTP誘變選育赤蘚糖醇高產(chǎn)菌株

以菌株WC18為對象，進(jìn)一步采用ARTP處理。結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞致死率逐步上升，其中處理時(shí)間為50 s時(shí)，細(xì)胞致死率達(dá)96.5%，而當(dāng)處理時(shí)間為100 s 時(shí)，細(xì)胞致死率為100%（圖2-A）。為考察ARTP 誘變最佳條件，分別挑取不同處理時(shí)間下的59 株菌進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，誘變時(shí)間為20 和40 s時(shí)，菌株發(fā)生負(fù)突變的概率較大，分別為40% 和44.44% （圖2-B）。當(dāng)誘變時(shí)間為50 s時(shí)，在選取的15株菌中，正突變和負(fù)突變的菌株數(shù)分別為5 和7，正負(fù)突變率分別為33.33%和46.67%。類似地，當(dāng)誘變時(shí)間增加至60 s，在所挑選的菌株中，正負(fù)突變率均為40%。然而，進(jìn)一步增加誘變時(shí)間時(shí)，菌株發(fā)生負(fù)突變的概率增加明顯，可達(dá)80%。在挑取的所有突變菌株中，赤蘚糖醇最高產(chǎn)量可達(dá)60.80 g·L-1，是出發(fā)菌株WC18的1.50倍。緊接著對該菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性測試，結(jié)果顯示在連續(xù)轉(zhuǎn)接20 次后，該菌株的赤蘚糖醇產(chǎn)量仍然穩(wěn)定（圖2-C）。綜合可知，ARTP最佳誘變時(shí)間在50～60 s 之間，并在WC18 基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步誘變篩選獲得一株赤蘚糖醇產(chǎn)量明顯提升的優(yōu)良菌株，將其命名為解脂亞羅酵母CA20。

圖2 ARTP誘變及菌株篩選Fig.2 Screen of strains with enhanced synthesis of erythritol by ARTP mutation

2.3 培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對解脂亞羅酵母CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響

為確定赤蘚糖醇發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基組分，首先考察了不同碳源濃度、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、表面活性劑、金屬離子、初始pH 值和裝液量對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，在測試的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鉀、維生素B1、肌醇六磷酸和司班20中，隨著各成分濃度的增加，赤蘚糖醇的產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，表明所選測試濃度合適，其中各組分的最佳濃度為300 g·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1、5 mg·L-1、5 g·L-1、10 mg·L-1、1 mg·L-1、25 mg·L-1和100 mg·L-1（圖3）。在最佳濃度條件下，赤蘚糖醇產(chǎn)量皆在P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001水平顯著高于最低濃度條件。

圖3 培養(yǎng)基成分對CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響Fig.3 The effect of medium compositions on the erythritol production by CA20

培養(yǎng)基中分別添加吐溫80、硫酸鎂和硫酸亞鐵亦可促進(jìn)細(xì)胞合成赤蘚糖醇，其最佳添加濃度分別在5 mg·L-1、1 mg·L-1和0.001 mg·L-1，該條件下赤蘚糖醇產(chǎn)量顯著高于最低濃度條件（P＜0.05，圖4）。此外，搖瓶裝液量和發(fā)酵初始pH 對細(xì)胞合成赤蘚糖醇具有重要影響，其中最佳裝液量和發(fā)酵初始pH 值為30 mL 和5.5。相比于葡萄糖等14 種單因素對酵母細(xì)胞合成赤蘚糖醇的影響，研究發(fā)現(xiàn)硫酸銅、氯化鈣、硫酸鋅和硫酸錳的添加對細(xì)胞合成赤蘚糖醇無明顯促進(jìn)作用。

圖4 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件對CA20產(chǎn)赤蘚糖醇的影響Fig.4 The effect of medium compositions and culture conditions on the erythritol production by CA20

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

基于單因素結(jié)果，選取14因素和3水平進(jìn)行PB設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。根據(jù)PB 設(shè)計(jì)，赤蘚糖醇的產(chǎn)量范圍在16.23～92.02 g·L-1。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果顯示模型F值為23.96（P＜0.01），表明模型可信且具有意義，R2=0.963 2 表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)大部分可用該模型解釋（表3）。另外根據(jù)F值可知，對酵母細(xì)胞合成赤蘚糖醇影響極顯著（P＜0.01）的因素表現(xiàn)為C＞B＞A，影響顯著（P＜0.05）的因素表現(xiàn)為K＞I＞L＞M＞H。為獲得最佳培養(yǎng)基組合及培養(yǎng)條件，利用軟件對PB數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，選取擬合后赤蘚糖醇產(chǎn)量最高組分進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵驗(yàn)證。模擬所獲赤蘚糖醇最高產(chǎn)量為93.40 g·L-1，實(shí)際發(fā)酵試驗(yàn)中，赤蘚糖醇產(chǎn)量為122.60 g·L-1，表明PB 模擬結(jié)果可靠。因此，模擬后的最佳組分：243 g·L-1葡萄糖、1.92 g·L-1酵母粉、2.98 g·L-1蛋白胨、4.70 mg·L-1硫酸銨、6.85 g·L-1氯化鈉、3.30 mg·L-1磷酸二氫鉀、0.65 mg·L-1維生素B1、49 mg·L-1肌醇六磷酸、193 mg·L-1司班20、7 mg·L-1吐溫80、0.42 mg·L-1硫酸鎂、0.002 mg·L-1硫酸亞鐵、裝液量21 mL 和初始pH值5.98，并使用該組分進(jìn)行后續(xù)赤蘚糖醇的罐上發(fā)酵試驗(yàn)。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of Plackett-Burman

表3 PB試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of results from Plackett-Burman design

2.5 不同培養(yǎng)模式對解脂亞羅酵母CA20 發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的影響

為探索不同培養(yǎng)模式對酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇的影響，比較了分批發(fā)酵（BF）和兩階段pH 調(diào)控分批發(fā)酵下（TSBF1 和TSBF2）赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率。結(jié)果顯示，在分批發(fā)酵中，發(fā)酵液pH 值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而逐步降低，最終穩(wěn)定在4左右，葡萄糖濃度在192 h后接近于0，赤蘚糖醇產(chǎn)量為131 g·L-1（圖5-A）。相比于分批發(fā)酵，TSBF1模式下，赤蘚糖醇產(chǎn)量可提高至142 g·L-1（圖5-B）。進(jìn)一步在第一階段和第二階段分別控制pH 值為6.0 和4.0 條件下，赤蘚糖醇產(chǎn)量可進(jìn)一步增加至156 g·L-1（圖5-C）。

從得率角度分析，TSBF2 模式下赤蘚糖醇的得率為0.58 g·g-1，顯著高于BF模式下的0.54 g·g-1（表4，P＜0.05）。然而兩階段發(fā)酵周期較長，因此TSBF1 和TSBF2 模式下的赤蘚糖醇產(chǎn)率均低于BF 模式。其中，TSBF1 和TSBF2 模式下的赤蘚糖產(chǎn)率分別為0.59 和0.61 g·L-1·h-1，顯著低于BF 模式下的0.68 g·L-1·h-1（P＜0.01）。此外，TSBF1 和TSBF2 模式下的單位細(xì)胞得率分別為22.59和17.69 g·g-1DCW，顯著高于BF模式下的6.65 g·g-1DCW （P＜0.001），這主要因?yàn)檩^低pH 值條件下細(xì)胞濃度較低，同時(shí)也表明較低pH 值條件下有利于細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇（圖5-D）。綜合上述結(jié)果可知，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH 值，可實(shí)現(xiàn)赤蘚糖醇產(chǎn)量和得率的提升。

圖5 不同培養(yǎng)模式下的赤蘚糖醇發(fā)酵過程曲線Fig.5 Fermentation curves of erythritol under different cultivation modes

表4 不同培養(yǎng)模式下赤蘚糖醇的得率、產(chǎn)率和單位細(xì)胞得率Table 4 The effect of cultivation modes on the yield，productivity and yield per DCW of erythritol

3 討論

工業(yè)菌種選育過程中，誘變是主要方法之一。針對赤蘚糖醇生產(chǎn)菌種的誘變選育，先前研究主要以紫外線和化學(xué)誘變?yōu)橹鳎?-8］。紫外誘變雖然操作簡單，但菌株誘變后的正突變率相對較低，菌株篩選過程比較耗時(shí)［16］，而使用化學(xué)試劑進(jìn)行誘變易對環(huán)境產(chǎn)生污染。相較于紫外誘變和化學(xué)誘變，γ 射線誘變和ARTP誘變方法具有突變率高和環(huán)境友好等特點(diǎn)［12］。然而，目前兩種方法在赤蘚糖醇高產(chǎn)菌種的選育中尚未被深入應(yīng)用。本研究證實(shí)，γ射線輻射結(jié)合ARTP誘變可用于高產(chǎn)赤蘚糖醇解脂亞羅酵母的快速和高效選育，具體表現(xiàn)為突變菌株篩選過程短，篩選菌株數(shù)量較少，在合適的誘變劑量和時(shí)間條件下，得到的正突變菌株數(shù)多。在最佳誘變條件下，本研究最終獲得一株高產(chǎn)菌CA20，赤蘚糖醇產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株WT5 提高141.27%。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)γ射線輻射和ARTP誘變產(chǎn)生高正突變率的同時(shí)，負(fù)突變率也較高，表明一定條件下兩種誘變方法對解脂亞羅酵母的性狀影響均較為明顯，在實(shí)際的育種過程中需要選擇合適的劑量和處理時(shí)間。

前人研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件對解脂亞羅酵母代謝合成赤蘚糖醇影響明顯，其中溶液滲透壓是主要因素［17-18］。本研究中，葡萄糖添加量與溶液滲透壓密切相關(guān)，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，初始葡萄糖濃度在300 g·L-1左右時(shí)有利于酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，而優(yōu)化后的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度在250 g·L-1時(shí)赤蘚糖醇產(chǎn)量最高。前人研究表明，除碳源以外，可通過添加金屬離子、表面活性劑以及控制碳氮比以增加赤蘚糖醇還原酶活性，從而增加細(xì)胞的赤蘚糖醇合成量［4，19］；在培養(yǎng)基中加入Cu2+和Zn2+能夠增加胞內(nèi)赤蘚糖還原酶的活性，從而促進(jìn)赤蘚糖醇的合成［20］；此外，Mn2+可促進(jìn)赤蘚糖醇由胞內(nèi)到胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)過程［21］。Lee等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入10 mg·L-1CuSO4·5H2O和10 mg·L-1MnSO4·4H2O 可使胞內(nèi)赤蘚糖還原酶活性提高34%，最終赤蘚糖醇產(chǎn)量提高33%。但本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加硫酸銅、氯化鈣、硫酸鋅和硫酸錳未能促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，而加入硫酸鎂和硫酸亞鐵有助于提升赤蘚糖醇產(chǎn)量，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步分析。除此以外，在培養(yǎng)基中添加表面活性劑可影響細(xì)胞形態(tài)以及胞內(nèi)還原酶活性［23-24］。Kang 等［23］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入甜菜堿、吐溫20或吐溫80可顯著增加球頭三型孢菌赤蘚糖醇產(chǎn)量。類似地，本研究表明添加一定濃度吐溫80 和司班20 可促進(jìn)解脂亞羅酵母代謝合成赤蘚糖醇。另外，本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加維生素B1和肌醇六磷酸有助于細(xì)胞合成赤蘚糖醇，與先前研究結(jié)果一致［25-26］。

前人研究表明，不同培養(yǎng)模式如分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵等對酵母細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇影響顯著［4］。Rakicka 等［27］發(fā)現(xiàn)兩階段連續(xù)發(fā)酵條件下赤蘚糖醇的產(chǎn)量可達(dá)199.4 g·L-1，是分批發(fā)酵條件下的2.5倍。Liu等［28］研究表明高滲透壓和較低的pH 值條件（pH 值為3.0）有助于細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇。另一項(xiàng)研究中，Mirończuk 等［29］使用兩階段發(fā)酵法，即第一階段使用30 g·L-1糖蜜作為碳源促進(jìn)細(xì)胞生長，第二階段使用200 g·L-1的甘油作為碳源促進(jìn)細(xì)胞合成赤蘚糖醇，最終得到赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率分別為113.9 g·L-1和0.57 g·g-1。本研究表明，發(fā)酵第一階段使用較低濃度葡萄糖（50 g·L-1）且維持體系pH 值在6.0 可以促進(jìn)細(xì)胞生長，而第二階段維持pH 值在4.0 可以促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇，最終所獲赤蘚糖醇的產(chǎn)量和得率分別為156 g·L-1和0.58 g·g-1，顯著高于分批發(fā)酵模式下的131 g·L-1和0.54 g·g-1。此外，是否可以通過其他培養(yǎng)模式，如連續(xù)發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵，從而進(jìn)一步提高解脂亞羅酵母CA20 的赤蘚糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，仍有待進(jìn)一步研究。

近年來，結(jié)合代謝途徑改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，如過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase）和赤蘚糖還原酶（erythrose reductase）等，赤蘚糖醇產(chǎn)量已達(dá)200 g·L-1左右，得率已達(dá)0.60 g·g-1，最高產(chǎn)率已超過2.0 g·L-1·h-1［30-32］。本研究結(jié)果與該研究相比仍有所不足，下一步可通過代謝改造和工藝優(yōu)化提升解脂亞羅酵母CA20 赤蘚糖醇產(chǎn)率，從而降低生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ 射線和ARTP 復(fù)合誘變用于高性能解脂亞羅酵母的選育，具有篩選周期短和正突變率高的特點(diǎn)，其中最佳條件為輻射劑量1 200 Gy和處理時(shí)間60 s，所獲菌株CA20赤蘚糖醇產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株WT5 提高141.27%；培養(yǎng)基中添加Fe2+、Mg2+、吐溫80和司班20有助于促進(jìn)細(xì)胞代謝合成赤蘚糖醇；采用TSBF2 培養(yǎng)模式可顯著提高赤蘚糖醇產(chǎn)量和產(chǎn)率。后期可通過基因組測序挖掘突變菌株高產(chǎn)赤蘚糖醇的分子機(jī)理，指導(dǎo)高產(chǎn)菌種的定向選育和改造。