家畜胚胎移植技術(shù)方案比較研究進展

王立強，呂 靜，江中良，蘇利紅

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西西安 712100）

胚胎移植作為現(xiàn)代動物繁殖的重要技術(shù)之一，在家畜品種改良、快速擴繁中發(fā)揮著不可替代的作用。胚胎移植是一個系統(tǒng)工程[1]，包括同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植和保存等環(huán)節(jié)，有多種不同的藥品和使用方案，且動物本身、藥品來源和劑量、季節(jié)、營養(yǎng)水平等都會影響胚胎移植效果，從而改變了胚胎移植的成本[2-4]。因此，本文通過概述胚胎移植不同環(huán)節(jié)操作過程與方法，明晰其優(yōu)缺點，以篩選操作簡單、效果佳、成本低的藥品和方案，為胚胎移植項目在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 同期發(fā)情

同期發(fā)情技術(shù)是大規(guī)模胚胎移植的重要環(huán)節(jié)之一，可有效提高受體的移植效率[5]。同期發(fā)情程度的高低與移植妊娠率緊密相關(guān)，受供體與受體子宮狀態(tài)的影響，胚胎移植要求供體和受體的發(fā)情時間相差不超過24h[6]。誘導母畜同期發(fā)情的激素有孕酮（P4）、前列腺素（PG）和促性腺激素釋放激素（GnRH）及其類似物等[7]。GnRH 通過促進母牛分泌促黃體素和卵泡刺激素（FSH），降低P4 濃度，導致卵巢中周期性黃體的退化，以利于卵泡的生長發(fā)育。一種GnRH的人工合成類似物—布舍瑞林，主要作用于垂體，也被用作同期發(fā)情的藥品，其具有活性強，半衰期長的特點，是一種新型激素藥品。陰道栓（CIDR）類似于“人工黃體”[8]，可在母畜陰道內(nèi)持續(xù)分泌P4，在取出CIDR 后注射PG，可有效提高同期發(fā)情效果[6]。

同期發(fā)情的方法主要包括一次前列腺素（PG）法、二次前列腺素（PG+PG）法、陰道栓加前列腺素（CIDR+PG）法、陰道栓加前列腺素加促性腺激素釋放激素（CIDR+PG+GnRH）法、促性腺激素釋放激素加前列腺素加促性腺激素釋放激素（GnRH+PG+GnRH）法等。

PG 法：對處于發(fā)情周期第10 天左右的供、受體母畜一次肌肉注射PGF2α類似物氯前列烯醇誘導發(fā)情[9]。這種方法具有操作簡單、方便快捷、成本低等特點，但同情發(fā)情率不高。

PG+PG 法：在受體母畜發(fā)情周期的任意1d（記作第0 天）注射一次PGF2α或氯前列烯醇后，間隔一定時間再次肌注PGF2α或氯前列烯醇，做好標記并觀察發(fā)情狀況，準確記錄發(fā)情時間和發(fā)情率[6,10,11]。這種方法增加了藥品成本和時間，具有一定的可操作性。

CIDR+PG 法：在受體母畜發(fā)情周期的任意1d（記作第0 天）放入含有黃體酮的陰道栓，一段時間后取出陰道栓，同時肌注PGF2α[12,13]。這種方法增加了成本，但效果較好。

CIDR+PG+GnRH 法：在受體母畜發(fā)情周期的任意1d（記作第0 天）埋植CIDR，一定時間后取栓并肌注PGF2α，2d 后肌注GnRH 當天就可觀察發(fā)情狀況[6]。這種方法操作較復雜，但是效果較好。

GnRH+PG+GnRH 法：在受體母畜發(fā)情周期的任意1d（記作第0 天）肌注GnRH，一定時間后肌注PGF2α，2d 后再次肌注GnRH，在當天就可觀察發(fā)情狀況[6,10]。這種方法成本稍低，但是效果較好。

CIDR+PG+E2 法：將在CIDR 放入受體母畜的將陰道內(nèi)，同時注射E2（雌二醇），一定時間后取出CIDR，同時注射PG 和E2。取出CIDR 的第2 天開始觀察發(fā)情[12]。這種操作方法程序復雜，成本高，但同期發(fā)情效果明顯。

2 超數(shù)排卵

超數(shù)排卵技術(shù)的應(yīng)用大大提高了擴繁效果和胚胎移植效益，是獲取優(yōu)良品種后代的主要技術(shù)之一。然而受各種因素的影響，使用不同方案超排處理后獲得的胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)會存在差異。

超數(shù)排卵使用的促性腺激素有：FSH、孕馬血清促性腺激素（PMSG）和重組FSH（rFSH）等[13]。FSH 半衰期短，無法持續(xù)刺激卵巢，常用方案是以遞減劑量每12h 注射FSH，連續(xù)注射3～5d，工作量較大，人力物力成本大，且易引起供體母畜產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。PMSG 在體內(nèi)的半衰期長達96h，會過度刺激卵巢，造成對排卵、受精和胚胎發(fā)育的不利影響[14]，因此在牛羊上很少使用PMSG。GnRH 可使促黃體素濃度升高以刺激排卵，在超排處理中使用GnRH 及其類似物可以提高超排效果。rFSH 是通過重組技術(shù)對FSH 的結(jié)構(gòu)基因組進行改造，以延長FSH 在體內(nèi)的半衰期，從而減少注射次數(shù)，減輕動物的應(yīng)激反應(yīng)和操作人員的工作量，然而目前不同劑量和rFSH 類型的超排效果不穩(wěn)定[15,16]。

供體母畜的超數(shù)排卵方案通常有以下幾種：①FSH+PG 法；② FSH+PG+CIDR+GnRH 法；③PMSG+PG 法；④CIDR+FSH+PG 法；⑤一次FSH 法。

（1）FSH+PG 法：供體母畜發(fā)情當天記為第0天，在發(fā)情周期的一定時間內(nèi)注射FSH 進行超排處理，采用遞減法連續(xù)注射3～4d（2 次/d），在第5 和6 次注射FSH 的同時，肌注前列腺素PGF2α[17]，獲得可用胚數(shù)為4.2 枚?？籽┩萚9]使用此方案對南陽牛進行超排處理，發(fā)現(xiàn)育成牛和經(jīng)產(chǎn)牛比較適宜的FSH 劑量分別為300、330mg/頭。

（2）FSH+PG+CIDR+GnRH 法：在供體母畜發(fā)情當天，將CIDR 放置到陰道內(nèi)，一定時間后肌注GnRH，隨后遞減法分3d 注射FSH，在最后一次注射FSH 后，取出CIDR 的同時注射PGF2α以誘發(fā)排卵。喬海生等[14]采用此方案平均獲得的胚胎數(shù)為8.8 枚/頭。

（3）PMSG+PG 法：在供體母畜發(fā)情后的一定時間，肌注PMSG，2d 后肌注PGF2α[17]。但是由于PMSG 的半衰期長，會導致卵巢過度刺激，因此在生產(chǎn)上較少使用此方法。

（4）CIDR+FSH+PG 法：結(jié)合CIDR 同期發(fā)情處理，將CIDR 放入陰道當天記為第0 天，一定時間后按照遞減法連續(xù)3～5d 肌注FSH，2 次/d，然后取栓，同時肌注PG。岳成廣[6]采用此方法，獲得的平均胚胎數(shù)和平均可用胚胎數(shù)分別為7.11 和4.67 枚。需要注意的是，兩次注射PGF2α在時間限制上非常嚴格，不易把控。

（5）一次FSH 法：由于FSH 半衰期短，1 次注射FSH 無法持續(xù)刺激卵巢，超排效果差。可以將FSH 溶于緩釋劑中延長其半衰期[18]，Hesser 等[15]采用這種方法獲得可移植牛胚胎達到9.6 枚。

3 胚胎采集

要根據(jù)不同的物種來確定胚胎采集時間。可采用手術(shù)法和非手術(shù)法收集胚胎。早期研究中通常用手術(shù)法采集胚胎，近年來在大動物上常用非手術(shù)法進行胚胎采集，可最大限度地減小對生殖道的損傷，且操作方法相對簡單[18,19]。

胚胎采集用液體有杜氏磷酸緩沖液、林格液、布林斯特氏液等。常用的為杜氏磷酸緩沖液，可加入0.4%的牛血清蛋白或1%～10%小牛血清，成本較低且配制簡單，已被廣泛使用。另外，布林斯特氏液效果也較好[18]。

4 胚胎保存

對獲得的優(yōu)秀胚胎，如果不能一次全部移植，就需要進行保存，其保存方法如下。

（1）傳統(tǒng)冷凍法：是在室溫下將胚胎放入小分子滲透性冷凍保護劑中，通過平衡后在-5～7℃誘發(fā)結(jié)晶；再以0.2～2.0℃/min 速度冷凍，在-35～-75℃時浸入液氮，并保存在液氮中。在解凍時以大約250℃/min 進行，在培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移前室溫下脫冷凍劑[20]。

（2）一步細管冷凍保存法：使用乙二醇或丙二醇作為冷凍保存劑進行胚胎冷凍，冷凍和解凍方法類似于傳統(tǒng)方法[21]。在解凍后，需要將胚胎連同冷凍保護劑一起注入母畜生殖道內(nèi)，不需要解凍液，因此不需要特定的儀器設(shè)備，操作簡單，是胚胎移植產(chǎn)業(yè)化最理想的方法之一。

（3）快速冷凍法：將冷凍速度提高到1250℃/min，使用的冷凍保存液不同濃度的滲透性冷凍保存液混合物。在平衡后，將處于部分脫水的胚胎放入液氮蒸氣中熏蒸后浸入液氮中[22]。此方法可能會導致細胞內(nèi)形成冰晶，解凍時需特別注意解凍速度，如果操作不當會對胚胎造成損傷，冷凍后存活率較低。

（4）玻璃化冷凍法：一種快速簡單有效的胚胎冷凍保存方法，通過簡化冷凍過程，減少了冷凍前后分步處理的步驟，還不需要冷凍儀器，在近年來運用較多[23]。

5 胚胎移植

胚胎移植包括手術(shù)胚胎移植法、陰道穿刺胚胎移植法、非手術(shù)胚胎移植法。

5.1 手術(shù)胚胎移植法

類似于采卵，可以在右肷部切口，將吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宮角前端，把胚胎輸入子宮角內(nèi)；也可在腹中線切口，在每側(cè)子宮角分別注入一定數(shù)量的胚胎。最后將子宮復位，并縫合切口。移植操作要謹慎小心，防止損傷子宮，對受胎造成不利影響[24]。這種方法通常在小動物上使用。

5.2 非手術(shù)胚胎移植法

這種方法通常在牛、馬等大動物上使用。移植時，用0.25mL 細管分三段吸入PBS 保存液和胚胎，前后由兩個氣泡隔開。剪去細管封口端后，借助一定的器械，把吸管推入受體母畜黃體一側(cè)子宮角，并使其深入到子宮角的大彎部[20]。應(yīng)將胚胎移植到有黃體一側(cè)子宮角的上1/3～1/2 處（子宮角尖端），如有可能越深越好。要求操作人員在短時間內(nèi)將胚胎移植到位，移植凍胚原則上不超過10min[24]。

5.3 陰道穿刺胚胎移植法

在陰道切一小口，將金屬細管穿透子宮壁進入宮腔內(nèi)，再通過裝有胚胎的注射器，將胚胎注入子宮腔內(nèi)。該方法可避開子宮頸口，以減少對宮口的刺激，但是易粘連[25]。這種方法容易引起母畜陰道損傷，導致炎癥發(fā)生從而降低妊娠率。

6 小結(jié)

作為現(xiàn)代動物繁殖的重要技術(shù)之一，胚胎移植也是種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益的重要途徑。在胚胎移植的不同技術(shù)環(huán)節(jié)中，采用GnRH+PG+GnRH 法進行同期發(fā)情經(jīng)濟實用，效果良好；選用CIDR+FSH+PG 方案進行超排處理效果良好；同時，玻璃化冷凍法是一種快速、簡單、有效的胚胎冷凍保存方法，便于在生產(chǎn)實踐中推廣運用；此外，要根據(jù)物種選擇不同的移植方法。