高爾基體蛋白73在肝細胞癌中上調的機制及診斷價值的研究

李偉 孫航 吳傳新

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全球第6位常見癌癥和第3位癌癥死亡原因，2020年全球新增PLC患者超過90萬例，死亡患者達83萬例，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的PLC類型［1］。HCC患者預后取決于腫瘤分期，早期患者接受根治性治療后5年生存率可達50%～70%，而進展期患者喪失了根治性治療機會，3年生存率僅為10%～40%［2］。然而HCC早期并無特異癥狀，多數(shù)HCC患者在確診時已經處于疾病中晚期，導致患者預后不佳。因此，早期診斷、治療是改善患者預后的關鍵。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是HCC高危人群監(jiān)測的首選腫瘤標志物［3-4］。但有研究［5］發(fā)現(xiàn)，在早期HCC僅有10%～20%的患者AFP水平升高，并不能滿足臨床早期診斷的需要。近年來多項研究［6-9］發(fā)現(xiàn)高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）在HCC患者中表達水平上調，是一種潛在的HCC標志物。關于HCC患者體內GP73上調的機制及與目前常用的HCC標志物對比的研究較少且結論并不統(tǒng)一。因此，本文對GP73在HCC患者中的上調機制及臨床常用的HCC標志物進行綜述，進一步明確GP73作為HCC標志物的價值。

1 GP73概述

1.1 GP73的發(fā)現(xiàn)及其結構 2000年，KLADNEY等［10］從巨細胞肝炎患者的肝臟cDNA文庫中篩選出的一種新的Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，其相對分子質量為73kDa，因此命名為GP73。HU等［11］根據蛋白質序列和結構分析發(fā)現(xiàn)GP73具有5個結構域，Ⅰ區(qū)為胞質結構域，Ⅱ區(qū)為跨膜結構域，Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)共同決定了GP73定位于高爾基體；Ⅲ區(qū)為卷曲螺旋結構域，介導了GP73的二聚體形成和與其他蛋白的相互作用；Ⅳ區(qū)為無定形結構域；Ⅴ區(qū)為酸性結構域。BACHERT等［12］發(fā)現(xiàn)人體內的GP73有2種存在形式，一種存在于高爾基體膜上，另一種存在于血清中；同時，他們發(fā)現(xiàn)定位于高爾基體膜上的GP73在N端第55位氨基酸附近存在原蛋白轉化酶共識別位點，通過原蛋白水解酶Furin作用可使C端的胞外結構域釋放，轉變?yōu)榭扇苄缘腉P73進入血液循環(huán)。魏豐賢等［13］將存在于高爾基體膜上和血清中的GP73分別命名為組織型GP73（tissue GP73，tGP73）和血清型GP73（serum GP73，sGP73）。GONG等［14］通過對2599 bp的啟動子片段刪減分析確定GP73編碼基因啟動子上存在活性激活區(qū)、活性抑制區(qū)及核心區(qū)等區(qū)域，這一發(fā)現(xiàn)對GP73在HCC患者體內表達水平調節(jié)的研究具有重要意義。

1.2 GP73的分布 GP73在胃、結腸、支氣管、腎、前列腺和膽管上皮細胞中均有低水平的表達，而在正常肝細胞中通常不表達［10］。研究［15］發(fā)現(xiàn)在發(fā)生炎癥（包括病毒性和非病毒性）、纖維化、癌變等變化的肝細胞中tGP73表達上調，且患者體內sGP73濃度也相應升高，這種sGP73水平上調在HCC患者尤為明顯［9，16］，表明sGP73具有作為HCC標志物的潛力。

1.3 GP73的生物學功能 目前關于GP73的生物學功能的研究尚不明確，WRIGHT等［17］通過截短GP73編碼基因導致模型小鼠發(fā)生不同程度的肝腎疾病，表明GP73在肝臟和腎臟正常代謝中具有重要作用。KIM等［18］通過對GP73在非洲爪蟾模型中發(fā)育作用的研究發(fā)現(xiàn)GP73在組織分化中具有一定作用，且sGP73可通過抑制白細胞介素-12的產生來調節(jié)樹突狀細胞的活性，間接抑制T細胞的反應性，進而影響免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。WANG等［19］建立了GP73基因敲除小鼠模型，并對模型小鼠進行部分肝切除，術后監(jiān)測結果提示GP73可以在早期促進肝細胞從靜止期進入復制前期，從而促進肝細胞再生，且模型小鼠術后炎癥反應輕，表明GP73具有促進肝臟損傷修復、調節(jié)炎癥反應的作用。

2 sGP73與常見HCC腫瘤標志物對比

目前已被證實的具有診斷價值的HCC標志物包括AFP［20］、甲胎蛋白異質體（Lens culinaris-agglutinin-reactive fraction of AFP，AFP-L3）［21-22］、異常凝血酶原（Des-γ-carboxy prothrombin，DCP）［23］、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC-3）［24］。

2.1 sGP73與AFP AFP是目前應用最廣泛的HCC標志物，但臨床發(fā)現(xiàn)約40%的HCC患者AFP水平并不升高，且AFP水平易受活動性肝炎、生殖系統(tǒng)腫瘤、妊娠等影響［25］，其準確性并不讓人滿意。MAO等［26］通過一項多中心研究對1,690例健康成人、337例乙肝病毒攜帶者、512例肝硬化患者、789例HCC患者、61例其他惡性肝臟病變患者、206例良性肝臟病變患者及622例非PLC腫瘤患者的sGP73和AFP進行比較，發(fā)現(xiàn)sGP73對HCC的診斷敏感度為74.6%、特異度為97.4%，均高于AFP的58.2%、85.3%，這種差異在小肝癌（≤3 cm）患者中尤為明顯；同時，他們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測sGP73和AFP診斷HCC的敏感度為89.2%，特異度為85.2%，敏感度明顯高于單一指標檢測結果，表明sGP73與AFP聯(lián)合檢測可提高診斷HCC的準確性。孫景武等［9］發(fā)現(xiàn)sGP73與AFP診斷HCC的敏度分別為78.3%和64.7%，兩者聯(lián)合檢測時敏感度為81.7%，與Mao等研究結果相符。

2.2 sGP73與AFP-L3 根據與凝集素的結合能力不同，AFP可分為三種亞型：AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3，其中AFP-L3主要由HCC細胞產生［27］。甲胎蛋白異質體比率（AFP-L3%）與總AFP水平無關，在低AFP水平的HCC患者中具有較高診斷價值［28］。LIU等［29］通過對721例患者檢測發(fā)現(xiàn)sGP73與AFP-L3%在肝炎、肝硬化、HCC患者中表達水平升高，sGP73診斷HCC的敏感度、特異度分別為76.34%和80.09%，AFP-L3%的敏感度、特異度分別為67.74%和81.52%，表明sGP73診斷HCC敏感度高于AFP-L3%，特異度稍低于AFP-L3%；sGP73與AFP-L3%聯(lián)合診斷HCC的敏感度、特異度分別為78.49%與85.03%，較兩者單獨診斷HCC敏感度及特異度均有所提升。

2.3 sGP73與DCP DCP是一種由于凝血酶原前體羧化不足而產生的失活的凝血酶原，主要由HCC細胞產生，因此DCP被認為是一種有價值的HCC標志物［30-32］。ISMAIL等［33］通過檢測良性肝臟病變、HCC、非HCC的惡性腫瘤患者以及健康成人血清發(fā)現(xiàn)sGP73診斷HCC的敏感度稍高于DCP，兩者特異度相似。孫志玲［34］研究發(fā)現(xiàn)sGP73診斷HCC敏感度、特異度分別為84.78%和77.78%，DCP敏感度、特異度為70.65%和80%，與Ismail研究結論相符。上述研究均表明sGP73診斷HCC的敏感度高于DCP，兩者特異度相似。但由于在接受華法林抗凝劑治療或在缺乏維生素K等情況下DCP均升高，這也在一定程度上限制DCP在HCC診斷方面的應用［35］。

2.4 sGP73與GPC-3 GPC-3是一種硫酸肝素多糖蛋白，在正常成人組織中低表達或不表達［36-37］，在HCC患者表達水平明顯升高。ZHAO等［38］通過分析919例HCC患者和1549例非HCC患者的研究發(fā)現(xiàn)sGP73、GPC-3、AFP診斷HCC的敏感度分別為77%、59%和65%，特異度分別為93%、93%和88%，當三種標志物聯(lián)合檢測時診斷敏感度為91%，遠高于單一標志物，提示sGP73診斷準確性高于GPC-3，sGP73與GPC-3、AFP聯(lián)合檢測有助于提高診斷敏感度及特異度。黃彩云等［39］研究發(fā)現(xiàn)在AFP陰性的HCC患者中sGP73、AFP-L3、、GPC-3單獨診斷時敏感度分別為45%、48%、41%，特異度分別為97%、96%、91%，當三者聯(lián)合應用時敏感度、特異度分別為51%和99%，較單一腫瘤標志物均有明顯提升。表明在AFP陰性時，sGP73與GPC-3、AFP-L3聯(lián)合應用仍能較為高效的發(fā)現(xiàn)HCC患者。

3 HCC中GP73上調機制

3.1 NF-κB信號通路 YANG等［40］對4,211例肝?。ò?,085例HCC）患者研究發(fā)現(xiàn)患者體內脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）水平與sGP73水平呈正相關。經DCA處理后的人HCC細胞株中發(fā)現(xiàn)GP73的信使RNA表達水平升高，表明DCA可上調細胞內源性GP73的表達。在DCA處理后的細胞中NF-κB信號通路的中間產物表達上調，推測DCA能影響NF-κB信號通路活性；根據DCA上調GP73表達的作用能被NF-κB信號通路抑制劑減弱這一現(xiàn)象，證實DCA通過激活NF-κB信號通路上調GP73的表達。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，通過改變GP73啟動子能夠明顯降低DCA對GP73表達上調作用。YANG等學者證實DCA能夠通過激活NF-κB信號通路作用于GP73啟動子上調GP73的表達。

3.2 RTK/PI3K/Akt/mTOR信號通路 受體酪氨酸激酶（RTK）/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶點（mTOR）信號通路在調控細胞增殖中起重要作用。SUBBIAH等［41］通過免疫組化學方法發(fā)現(xiàn)在超過50%的HCC患者中可見到抑癌基因PTEN的缺失或改變，KHEMLIN等［42］發(fā)現(xiàn)PTEN的缺失激活了PI3K/Akt/mTOR軸，與VILLANUEVA等［43］、SAHIN等［44］發(fā)現(xiàn)的HCC患者中大多存在mTOR信號通路的異常激活一致。CHEN等［45］研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因缺失可導致mTOR過度激活，在相應PTEN基因缺失的細胞系中可發(fā)現(xiàn)GP73的轉錄及翻譯均增加，推測RTK/PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可上調GP73基因的表達。他們還發(fā)現(xiàn)GP73基因的這種表達上調可被mTOR抑制劑雷帕霉素逆轉，證實在HCC患者中mTOR信號通路能夠正向調節(jié)GP73基因表達。

3.3 STAT3信號通路 LIANG等［46］通過將不同細胞因子加入HepG2細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d后測量細胞中GP73信使RNA的水平，發(fā)現(xiàn)加入白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）可顯著上調GP73編碼基因的轉錄，通過線性回歸分析發(fā)現(xiàn)在HCC患者體內sGP73與IL-6存在正相關，但在正常人群中無相關性。同時，其還發(fā)現(xiàn)IL-6下游效應STAT3同樣可以上調GP73基因的轉錄與表達。

YAO等［47］在經重組人IL-6處理后的肝癌細胞株Huh7裂解液中發(fā)現(xiàn)GP73信使RNA水平增加，通過軟件預測GP73啟動子上存在STAT3的結合位點；其還在模擬實驗中發(fā)現(xiàn)原蛋白水解酶Furin表達水平在Huh7細胞中也同樣升高，推測Furin的啟動子區(qū)域存在潛在的STAT3結合位點。總之，IL-6激活STAT3信號通路，促進STAT3表達，與GP73及Furin啟動子結合，進而促進GP73與原蛋白水解酶Furin的表達，上調sGP73水平。上述研究表明在HCC患者體內GP73上調是通過各種信號通路產生能與GP73基因啟動子結合的信號因子，促進GP73基因的轉錄與翻譯。部分研究發(fā)現(xiàn)HCC患者體內在上調GP73基因表達時還上調了原蛋白水解酶Furin表達。BACHERT等［12］研究發(fā)現(xiàn)tGP73過度表達時其水解產生的sGP73水平隨之上調，當原蛋白水解酶Furin表達增加時，sGP73的上調更加明顯。因此，HCC患者體內sGP73水平通過上述機制上調。

4 小結

目前，盡管HCC治療方案逐漸多元化，但早期診斷仍是改善患者預后的關鍵，高?；颊叨ㄆ跈z測腫瘤標志物能早期發(fā)現(xiàn)HCC，進而達到早期治療，改善患者預后。AFP作為傳統(tǒng)的HCC標志物，單獨應用于診斷HCC時存在不足。多項研究［6-9，26，27，29，38，39］表明GP73作為HCC標志物對早期發(fā)現(xiàn)HCC具有重要意義，且與臨床常用標志物對比發(fā)現(xiàn)sGP73聯(lián)合其它常用的HCC標志物能提高診斷HCC的敏感度與特異度。目前，部分研究［6-7，9，29，48］發(fā)現(xiàn)在肝硬化中sGP73水平也有顯著升高，鑒于多數(shù)HCC患者合并肝硬化，有學者推測sGP73表達上調與肝硬化相關，因此后續(xù)需要開展一項多中心、大規(guī)模的臨床研究，以進一步證實sGP73在HCC診斷中的價值。相信隨著對GP73基因與HCC關系的更深入研究，GP73可以更好服務于臨床。