4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液的體外透皮擴(kuò)散評(píng)價(jià)

宿玥祺，劉俊霞

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

五味子是五味子科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實(shí)[1]，主要有效成分木脂素具有很低的極性，在水中溶解度低，因此在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中必須采用特定的溶媒[2]。脂質(zhì)體與細(xì)胞膜相似度高，適應(yīng)性好，不影響藥物的分子結(jié)構(gòu)和活性，可防止水解酶在體內(nèi)被破壞[3]。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(1260，美國(guó)安捷倫科技有限公司生產(chǎn))；可調(diào)高速勻漿機(jī)(FSH-2A，方科儀器有限公司生產(chǎn))；藥物透皮吸收儀(TT-6/TT-8，天津市正通科技有限公司生產(chǎn))。

試劑：五味子醇甲對(duì)照品(MUST-20082908，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所生產(chǎn))；膽固醇(20190301，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；大豆卵磷脂(C10537756，上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn))；十六烷基三甲基溴化銨(112-02-7，羅恩試劑)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 4種脂質(zhì)體及乳液的制備方法

常規(guī)脂質(zhì)體的制備。在量取的1 mL五味子木脂素提取液中加入大豆卵磷脂600 mg和膽固醇120 mg，用適量的無(wú)水乙醇定容至25 mL后搖勻，超聲約5～10 min充分溶解，于55 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，直至在茄形瓶瓶壁上有薄膜形成后再加入適量pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行水化超聲，使薄膜層完全脫落，得到脂質(zhì)體混懸液，于4 ℃下保存[4]。

柔性脂質(zhì)體的制備。通過(guò)超聲處理將吐溫-80溶解在無(wú)水乙醇中，按照吐溫-80∶卵磷脂=1∶6定容后混合均勻，制備出濃度為10 mg·mL-1的溶液。依照上述方法制備柔性脂質(zhì)體[4]。

陰離子脂質(zhì)體的制備。按制備柔性脂質(zhì)體混懸液的方法，加入150 mg十二烷基苯磺酸鈉，即可得到陰離子脂質(zhì)體，于4 ℃下保存。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備。將100 mg十六烷基三甲基溴化銨加入到柔性脂質(zhì)體混懸液中，即可得到陽(yáng)離子脂質(zhì)體，于4 ℃下保存。

乳液的制備。根據(jù)五味子木脂素脂質(zhì)體乳液的擬配方[5]篩選出最優(yōu)配比為：油相占比15%～30%，促透劑占比0.2%，保濕劑占比1%～5%，乳化劑占比1%～2%，黃原膠占比0.1%～0.2%，苯氧乙醇占比0.5%～1%，將水相加至100%。

精確稱量油相(脂質(zhì)體∶蜂蠟=6∶1)和水相(氮酮、乳化劑OP、山梨醇∶透明質(zhì)酸鈉=1∶1、黃原膠和磷酸緩沖溶液)，在80℃～85℃的條件下加熱至融解后把水相倒入到油相中乳化5 min，冷卻至40 ℃左右加入防腐劑(苯氧乙醇)，攪拌均勻，得到4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液[6]。

2.2 小鼠皮膚處理

將選取的健康雄性小鼠用頸椎脫臼法處死，用充氣筒給小鼠充氣至腹部繃緊，將毛發(fā)去除。將小鼠的腹部皮膚剝離后用浸有生理鹽水的脫脂棉球清潔皮下脂肪組織與結(jié)締組織，再用蒸餾水、生理鹽水反復(fù)沖洗，放入生理鹽水中，于4 ℃冷藏備用[7]。

2.3 擴(kuò)散裝置及接收液

采用的裝置是立式擴(kuò)散池，結(jié)構(gòu)如圖1所示，有效擴(kuò)散面積為0.635 85 cm2，接收池容量為5 mL。實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行檢漏，將合適大小的離體皮膚用彈簧夾固定于擴(kuò)散池中，角質(zhì)層一面朝向供給池，真皮層一面朝向接收池，在供給池中加入適量的水，觀察水位是否降低，如有滲漏情況則需調(diào)整彈簧夾[8]，放置磁力攪拌子，向接收池中注入5 mL接收液(1%吐溫-80溶液)，接收池的液體與真皮層之間不能存在氣泡。將4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液添加到供給池中，由于脂質(zhì)體在達(dá)到合適的水合梯度后才能進(jìn)行自發(fā)滲透，需利用薄膜等材料對(duì)供給池進(jìn)行半封口操作[9]。

圖1 立式擴(kuò)散池結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagram of vertical diffusion cell

2.4 體外透皮含量測(cè)定方法

2.4.1 色譜條件的建立

采用高效液相色譜方法(HPLC)對(duì)4種乳液接收液的含量進(jìn)行分析，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm)；流動(dòng)相：水(A)-甲醇(B)，洗脫比例0～35 min，68%B；35～40 min，68%～100%B；40～48 min，100%～100%B；48～52 min，100%～68%B；52～60 min，68%～68%B，流速1 mL·min-1，柱溫35 ℃，在波長(zhǎng)254 nm處進(jìn)行檢測(cè)，每次進(jìn)樣10 μL[6]。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在5 mg五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)品中加入甲醇，制備濃度為0.5 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。取適量混合對(duì)照品溶液與甲醇，按照一定比例配制出0.05mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，利用峰面積數(shù)據(jù)繪制五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)X為對(duì)照品溶液的濃度，縱坐標(biāo)Y為色譜峰面積。

2.4.3 樣品含量測(cè)定

在三批0.1 mL的4種乳液中加入適量甲醇，經(jīng)10 min超聲后加入無(wú)水乙醇定容搖勻，即得樣品溶液。按“2.4.1”中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中五味子醇甲的含量[10]。

2.5 4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液的體外透皮擴(kuò)散評(píng)價(jià)

2.5.1 體外透皮試驗(yàn)

將擴(kuò)散池在溫度34 ℃、轉(zhuǎn)速600 rpm·min-1的條件下平衡15 min，分別將1 mL的4種乳液加入到供給池，在第2、4、6、8、10、12、24 h取出1 mL接收液，注入等體積的新鮮接收液，在取出的接收液中加入甲醇定容至5 mL后超聲5 min，過(guò)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜后進(jìn)行含量測(cè)定。

2.5.2 單位累積透過(guò)量

利用下列公式分別計(jì)算出4種乳液的單位累積釋放量Qn：

其中，Cn為時(shí)間點(diǎn)t時(shí)對(duì)透皮后所得接收液取樣計(jì)算的濃度，Ci為時(shí)間點(diǎn)t的上一個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)透皮擴(kuò)散后所得接收液取樣計(jì)算的濃度，Vr為接收池的體積，Vs為所取透皮后接收液的體積，A代表擴(kuò)散池的有效擴(kuò)散面積。

3 測(cè)定結(jié)果與數(shù)據(jù)結(jié)果分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)“2.4.1”色譜條件下測(cè)得的五味子混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰如圖2所示。

注：峰1為五味子醇甲；峰2為五味子醇乙；峰3為五味子甲素；峰4為五味子乙素圖2 五味子混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard substance of Schisandra Chinensis

圖3 五味子醇甲標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of schisandrin

五味子醇甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=21 056X+4.19(R2=0.993 8)，如圖3所示，該結(jié)果表明在0.05～0.25 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 體外透皮含量的測(cè)定結(jié)果

對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，縱坐標(biāo)Qn為單位累積釋放量，橫坐標(biāo)t為取接收液的時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液的體外透皮單位累積透過(guò)量曲線Fig.4 Cumulative transmittal curve of transdermal unit in vitro of 4 kinds of lignan liposome lotion

4種五味子木脂素脂質(zhì)體乳液?jiǎn)挝焕鄯e透過(guò)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，陰離子脂質(zhì)體乳液在24 h時(shí)單位累積透過(guò)量最高，可達(dá)66.63 μg·cm-2，且隨時(shí)間的增加單位累積量呈直線上升，透皮速率最快，而常規(guī)脂質(zhì)體乳液?jiǎn)挝焕鄯e透過(guò)量最低。

4 結(jié)束語(yǔ)

將4種脂質(zhì)體作為木脂素的載體，按照篩選的最優(yōu)配比制備成乳液，通過(guò)體外透皮擴(kuò)散試驗(yàn)，以HPLC法作為定量方法，對(duì)4種乳液的透皮效果進(jìn)行分析，測(cè)量透皮吸收量，精密度高，準(zhǔn)確，線性與范圍好，透皮效果依次為：陰離子脂質(zhì)體乳液>陽(yáng)離子脂質(zhì)體乳液>柔性脂質(zhì)體乳液>常規(guī)脂質(zhì)體乳液。經(jīng)過(guò)體外透皮實(shí)驗(yàn)初步證明，用脂質(zhì)體制備的乳液能夠促進(jìn)透皮效果，提高生物利用度。該配方是一種乳劑，沒(méi)有從基質(zhì)中釋放出任何藥物。進(jìn)行透皮擴(kuò)散時(shí)，皮膚直接關(guān)系到藥物的透皮作用，配方中甲醇、氮酮作為促透劑也發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。離體皮膚的角質(zhì)層厚度和毛孔密度都會(huì)對(duì)透皮效果產(chǎn)生影響；接收液的性質(zhì)與體內(nèi)組織液性質(zhì)越接近透皮效果越好。處理后的鼠皮存放時(shí)間也有一定的影響，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則難以起到生物屏障的作用，所以實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡量控制在24 h內(nèi)完成。將脂質(zhì)體作為載體進(jìn)行體外透皮擴(kuò)散，可促進(jìn)五味子中活性成分的吸收效果或延長(zhǎng)在皮內(nèi)的滯留時(shí)間，具有良好的研究?jī)r(jià)值和廣闊的發(fā)展空間。