重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

◎ 王曉慶，張海韻，高 晗，賀 燕

（1.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410117；2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410117）

食品安全不僅關(guān)乎著人們的身體健康和生命安全，還關(guān)系到國(guó)計(jì)民生和社會(huì)穩(wěn)定[1]。隨著食品供應(yīng)鏈日益豐富和復(fù)雜，暴露出的食品安全問(wèn)題的種類和形式也越來(lái)越多，食品安全監(jiān)管工作也愈來(lái)愈困難。世界各國(guó)食品行業(yè)都對(duì)完善檢測(cè)方法加大了投入，探索更為簡(jiǎn)單、快速、有效的檢測(cè)方法。近年來(lái)，食源性疾病引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)報(bào)道，全球每年多達(dá)15億例微生物感染事件，其中460萬(wàn)人因食源性疾病而死亡[2]。在眾多食源性致病菌中，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及銅綠假單胞菌等影響范圍廣泛。食源性致病菌常規(guī)檢測(cè)技術(shù)包括增菌培養(yǎng)、純化分離、生化鑒定和血清型試驗(yàn)等過(guò)程，操作步驟煩瑣，檢測(cè)中，尤以乳、肉制品中金黃色葡萄球菌、生肉類中的沙門氏菌的靈敏度和特異性受限，不適合脫離實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，已不能滿足食源性致病菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求[3]。

1 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)概述

隨著生物技術(shù)研究的不斷深入，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)迅猛發(fā)展，尤其是PCR、多重PCR等體外模擬核酸擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域。重組酶聚合酶擴(kuò) 增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù)是2006年英國(guó)劍橋科學(xué)家Piepenburg等研發(fā)的，目前被稱為是可以替代PCR的一種新型體外核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)不依賴嚴(yán)格的熱循環(huán)控制，而是在多種酶和蛋白因子的輔助下，與目標(biāo)靶序列進(jìn)行同源重組，啟動(dòng)靶序列復(fù)制延伸，整個(gè)反應(yīng)無(wú)需變性，25～42 ℃恒溫20 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。相比于其他核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，RPA技術(shù)不僅具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，而且不受檢測(cè)環(huán)境的限制，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的依賴性很低。另外，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物可與多種技術(shù)結(jié)合，在不同條件和場(chǎng)景下可以選擇不同的方法進(jìn)行產(chǎn)物分析，特別適合于食品安全、體外診斷、農(nóng)業(yè)及生物安全等領(lǐng)域非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。英國(guó)TwistDX公司于2015年研發(fā)生產(chǎn)了RPA相關(guān)檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的出現(xiàn)大大推動(dòng)了該檢測(cè)技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生物檢測(cè)等眾多領(lǐng)域中的應(yīng)用[4]。

2 RPA技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

RPA技術(shù)由于不需加熱變性、不依賴實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和高端儀器、反應(yīng)速度快且靈敏高等特點(diǎn)，已在生命科學(xué)研究及檢測(cè)相關(guān)諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，已逐步滲透至食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，十分適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.1 RPA技術(shù)在金黃色葡萄球菌檢測(cè)中的應(yīng)用

金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，其主要存在于肉、奶、蛋及其制品中。由于其對(duì)人類健康存在嚴(yán)重的危害，已將其作為食品常規(guī)微生物檢測(cè)項(xiàng)目之一。金黃色葡萄球菌是一種人獸共患致病菌，生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求不高，對(duì)不良環(huán)境有很強(qiáng)的抵御能力，高溫干燥環(huán)境下能存活數(shù)月，被金黃色葡萄球菌污染的食品一旦被消費(fèi)者食用極易引起食物中毒。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心相關(guān)調(diào)查報(bào)告顯示，每年由金黃色葡萄球菌污染引起的食物中毒僅次于大腸桿菌，占細(xì)菌性食物中毒的比例高達(dá)30%，居第2位。相關(guān)報(bào)告顯示，我國(guó)每年因金黃色葡萄球菌污染而導(dǎo)致的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的比例也高達(dá)25%，位居第4位[5]。

目前，常用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的基因有編碼耐熱核酸酶nuc基因、編碼血漿凝固酶的coa基因、編碼腸毒素的基因sea以及輔助耐藥基因femA、femB。吳華華等[6]根據(jù)該菌耐熱核酸酶nuc基因，設(shè)計(jì)特異性RPA引物，結(jié)果顯示其具有較高的靈敏度且最低檢出限為10 CFU。徐健皓等[7]依據(jù)金黃色葡萄球菌輔助耐藥基因femB設(shè)計(jì)了多套R(shí)PA擴(kuò)增引物，并對(duì)引物的高靈敏度和特異性進(jìn)行篩選，建立了一種針對(duì)金黃色葡萄球菌的靈敏、特異、快速的RPA檢測(cè)方法。這些方法的建立，為預(yù)包裝、散裝食品中快速篩查金黃色葡萄球菌提供了參考。

2.2 RPA技術(shù)在沙門氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用

沙門氏菌是一種重要的食源性致病微生物，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性菌屬，共有2000多個(gè)血清型，在全球范圍廣泛分布。沙門氏菌不但可以使動(dòng)物致病，還會(huì)通過(guò)污染食物傳播給人類。在食品和飼料中，均要求沙門氏菌不得檢出。為了保障人類和動(dòng)物飲食安全，開(kāi)發(fā)能夠簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)沙門氏菌的方法尤為重要。

目前建立的沙門氏菌RPA檢測(cè)方法中，基本都依據(jù)invA設(shè)計(jì)特異性引物，該基因是存在于沙門氏菌中一組用于檢測(cè)的獨(dú)特保守基因序列，包括invA、invB、invC、invD和invE等，負(fù)責(zé)編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白。除此以外，外膜蛋白基因omp、菌毛亞單元的fimA、編碼腸毒素基因stn等靶基因也是RPA的研究對(duì)象。

KIM等[8]建立了雞肉和雞蛋中腸炎沙門氏菌熒光RPA快速檢測(cè)方法，將該方法和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相比較，兩者對(duì)該菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度一致。CHEN等[9]依據(jù)沙門氏菌的iroB基因設(shè)計(jì)了引物和探針，其最低檢出限可為102個(gè)模板DNA。黃國(guó)梁等[10]以鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的PhnT基因?yàn)槟繕?biāo)基因，設(shè)計(jì)引物和探針，均具有良好的特異性，靈敏度分別達(dá)到1×102copies·μL-1、1×101copies·μL-1和1×100copies·μL-1。周紅蕾等[11]以豬霍亂沙門氏菌侵襲蛋白A基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)特異性引物和探針，結(jié)果表明，建立的方法在39 ℃恒溫條件下15 min內(nèi)便可完成反應(yīng)，且特異性強(qiáng)，與單增李斯特菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌及副豬嗜血桿菌無(wú)交叉反應(yīng)，且檢測(cè)結(jié)果與PCR方法一致。

2.3 RPA技術(shù)在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用

單增李斯特氏菌是一種典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛存在于肉制品、乳制品及冷藏食品中，可引起嚴(yán)重的食源性疾病。其營(yíng)養(yǎng)要求不高，在自然界中4～45 ℃ 環(huán)境條件下均能生長(zhǎng)，對(duì)人畜的健康存在嚴(yán)重的危害。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 4789.30—2016中規(guī)定的方法過(guò)程煩瑣、周期長(zhǎng)，需要具備相關(guān)專業(yè)知識(shí)的人員進(jìn)行操作，不利于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢驗(yàn)。RPA技術(shù)作為一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在一定溫度下實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)倍擴(kuò)增，其極大地推動(dòng)了病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展。

郭正洋等[12]依據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌actA基因，通過(guò)比對(duì)分析獲得同源性較好的序列，設(shè)計(jì)RPA引物及探針，建立檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的熒光RPA方法，所建立的方法特異性強(qiáng)，只對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為檢出陽(yáng)性，對(duì)其他菌種無(wú)擴(kuò)增，該方法的檢出限為2.3×102CFU·mL-1。王金鳳等[13]以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌保守毒力基因hlyA為靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了快速檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的實(shí)時(shí)熒光RPA方法，結(jié)果表明其靈敏度可達(dá)到0.5 pg，且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和real-time PCR均一致，但是前者所需時(shí)間明顯短于后者。何潔等[14]針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的hlyA基因保守序列設(shè)計(jì)多組引物，篩選出一組特異性強(qiáng)且高效的引物，建立了單核細(xì)胞增生李斯特菌的RPA檢測(cè)體系，該方法在37 ℃條件下恒溫30 min便能夠特異地檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，檢出限低至0.5 ng·μL-1。

2.4 RPA技術(shù)在銅綠假單胞菌檢測(cè)中的應(yīng)用

銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，是一種非發(fā)酵性革蘭氏陰性菌，因其低營(yíng)養(yǎng)需求而廣泛存在于水環(huán)境中，對(duì)人類、動(dòng)物及植物都是條件性致病菌。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，包裝飲用水在人們?nèi)粘Ｉ钪谐霈F(xiàn)的頻次越來(lái)越高，有關(guān)銅綠假單胞菌污染的安全問(wèn)題也逐漸顯露出來(lái)。如果遇到食品安全突發(fā)事件，傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能及時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果，無(wú)法保障人們的飲食安全，成為公共衛(wèi)生和食品安全的重要隱患。因此，靈敏、高效、特異檢測(cè)方法的建立有望在基層和生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、便捷檢測(cè)，為銅綠假單胞菌的快速檢出和確證提供理論和技術(shù)參考。

銅綠假單胞菌基因組間差異大，其復(fù)雜度基本與釀酒酵母相當(dāng)。外毒素A的編碼基因toxA高度保守，可用作RPA的靶基因進(jìn)行研究[15]。此外，主要外膜脂蛋白的編碼基因oprI全長(zhǎng)363 bp，ORF長(zhǎng)249 bp，特異性好，常被作為研究對(duì)象進(jìn)行銅綠假單胞菌的檢測(cè)。劉輝等[16]根據(jù)銅綠假單胞菌基因組特征建立了檢測(cè)瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增法分析方法，該方法檢出限為10 pg·μL-1，且能夠在20 min內(nèi)特異地檢測(cè)出銅綠假單胞菌基因組模板，對(duì)人工污染的水樣最低檢出限為36 CFU·mL-1，且重復(fù)性良好。

除金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及銅綠假單胞菌外，RPA技術(shù)在檢測(cè)空腸彎曲桿菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌以及大腸桿菌O157:H7等方面也進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用研究。由于多重RPA技術(shù)的研發(fā)難度大大增加，需要對(duì)目標(biāo)序列、引物及探針濃度、反應(yīng)條件等多因素優(yōu)化，所以多數(shù)RPA技術(shù)是針對(duì)單一靶標(biāo)。由此可見(jiàn)，RPA方法在應(yīng)用中還有很多值得深度研究之處，如開(kāi)發(fā)針對(duì)多種致病菌，或血清型和耐藥基因等多種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)。對(duì)多種致病菌同時(shí)檢測(cè)方面，王鳳嬌等[17]建立了一種針對(duì)食品中蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌以及單核細(xì)胞增生李斯特菌3種致病菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的多重?zé)晒釸PA體系，并對(duì)實(shí)際售賣的盒飯、涼菜等方便即食食品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法一致。研究結(jié)果表明，RPA方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、重復(fù)反應(yīng)結(jié)果一致等特點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

食源性致病菌導(dǎo)致的疾病已是人類食品安全面臨的最大挑戰(zhàn)之一，由于傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)以及靈敏度和特異性的局限性，不適合脫離實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，已不能滿足我國(guó)對(duì)食源性致病菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。因此，體外模擬核酸反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌快速檢測(cè)方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

RPA技術(shù)作為一種新興的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，目前研究探討主要集中在醫(yī)療診斷、病原學(xué)檢測(cè)等方面，在食源性致病菌檢測(cè)方面雖然還起步不久，但已取得了相當(dāng)不錯(cuò)的成果，顯示出了巨大潛力，且在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、快速檢測(cè)設(shè)備研發(fā)方面都具有更為廣泛的應(yīng)用空間。RPA技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、易控、低成本，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行識(shí)別和確認(rèn)，從而實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)及資源匱乏地區(qū)等復(fù)雜環(huán)境中致病菌的快速檢測(cè)。

當(dāng)然，RPA技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)。最主要的是至今仍然沒(méi)有專門用于其引物設(shè)計(jì)的軟件，效果良好的引物與探針主要靠大量的合成與篩選，成本和時(shí)間消耗很大，有時(shí)甚至無(wú)法設(shè)計(jì)出理想的引物與探針。而且，由于其靈敏性高，容易因氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。隨著科學(xué)的迅猛發(fā)展及致病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)研究的深入，相關(guān)引物設(shè)計(jì)軟件開(kāi)發(fā)也逐漸完善，必將為RPA反應(yīng)體系的建立及應(yīng)用提供方便?？傊?，RPA技術(shù)作為一種較新的檢測(cè)技術(shù)，將其應(yīng)用于實(shí)際檢驗(yàn)中還需要不斷地摸索研究，相信通過(guò)不斷的技術(shù)創(chuàng)新和深入研究，必將為RPA的廣泛應(yīng)用提供保障，以應(yīng)用于檢測(cè)監(jiān)管領(lǐng)域，為公共衛(wèi)生事業(yè)保駕護(hù)航。