唾液腺緊密連接蛋白Claudin的研究進展

張鵬鑫，費潤馨，許 輝

緊密連接(tight junction，TJ)位于相鄰上皮接觸頂端區(qū)域的細胞間連接處，是參與旁細胞分泌途徑中蛋白質(zhì)間相互作用的復雜動態(tài)系統(tǒng)。其主要功能分別是通過限制分子在細胞間的自由擴散，實現(xiàn)其屏障功能；通過減少頂端和基底外側(cè)質(zhì)膜區(qū)域的相互影響，實現(xiàn)其柵欄功能，維持細胞極性[1-2]。緊密連接可構(gòu)成唾液腺血液和組織液之間的細胞屏障，維持唾液單向分泌[3]。

緊密連接蛋白分為跨膜蛋白和細胞質(zhì)蛋白，跨膜蛋白主要包括Claudin家族、Marvel蛋白家族、以及連接黏附分子家族。其中，Claudin家族構(gòu)成緊密連接鏈(緊密連接跨膜蛋白胞外環(huán))的主干，具有調(diào)節(jié)細胞通透性、增殖和分化等功能，并且對細胞生長及分化至關(guān)重要[4]。

Claudin蛋白表達模式與緊密連接結(jié)構(gòu)和功能有密切關(guān)系。通過順序敲除MDCK Ⅱ細胞系中主要表達的5種Claudin(Claudin-2、Claudin-4、Claudin-3、Claudin-7、Claudin-1)，生成五倍量Claudin基因敲除(quintuple knockout，quinKO)模型，觀察到緊密連接鏈缺失[5]。以上結(jié)果表明，Claudin是緊密連接結(jié)構(gòu)形成的必要條件。此外，大鼠唾液腺放射損傷后分泌功能降低，Claudin-4表達水平呈時間依賴性上調(diào)，透射電鏡下觀察到緊密連接寬度減小[6]。舍格倫綜合征患者唾液腺分泌功能低下，Claudin-1和Claudin-4從腺泡細胞頂端重新分布到基底外側(cè)[7]，表明Claudin蛋白與緊密連接功能關(guān)系密切。因此，本文就目前唾液腺常見Claudin蛋白的相關(guān)研究進展進行綜述。

1 Claudin蛋白概況

Claudin是現(xiàn)階段已知構(gòu)成緊密連接最大的跨膜蛋白家族，哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)27個成員，分子質(zhì)量為20～27 ku。Claudin家族具有4個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域及多個磷酸化位點和結(jié)合區(qū)域，其N—端和C—端位于細胞質(zhì)內(nèi)，形成2個胞外環(huán)和1個胞內(nèi)環(huán)[8]。Claudin蛋白根據(jù)序列可分為2組：①相似程度高的經(jīng)典蛋白Claudin-1～10、14、15、17和19；②非經(jīng)典蛋白Claudin-11～13、16、18和20～24[9]。

Claudin蛋白廣泛表達于各種上皮組織和內(nèi)皮組織。Claudin-5主要表達于血管內(nèi)皮組織，可影響其通透性，而流入下頜下腺的血流量增加是膽堿能誘導唾液分泌的基礎(chǔ)條件[10]。Claudin-1廣泛表達于上皮組織，敲除Claudin-1導致小鼠皮膚上皮對水和大分子物質(zhì)的緊密連接屏障作用喪失，在出生后1 d內(nèi)死于脫水[11]。目前，Claudin-1～12和16已在唾液腺中被檢測到。

2 Claudin蛋白亞型分述

2.1 Claudin-1

Claudin-1廣泛表達于各種鱗狀上皮組織[12]。研究發(fā)現(xiàn)舌鱗狀細胞癌患者體內(nèi)Claudin-1在腫瘤病變中心為膜定位，病灶侵襲前緣則同時具有細胞內(nèi)定位及膜定位，進一步比較發(fā)現(xiàn)Claudin-1高表達組中細胞內(nèi)定位的頸淋巴轉(zhuǎn)移率高于膜定位。因此，腫瘤侵襲前緣的細胞內(nèi)定位模式可能是一種有價值的舌鱗狀細胞癌診斷標志[13]。此外，多形性腺瘤、沃辛瘤、黏液表皮樣癌、上皮性肌上皮瘤和涎腺導管癌的Claudin-1主要位于導管細胞膜，腺樣囊性癌的Claudin-1主要位于緊密連接區(qū)[14]。上述結(jié)果表明Claudin-1分布位置可因腫瘤類型不同而發(fā)生變化。

Hollandsworth等[15]將Claudin-1抗體與IRDye800CW(一種近紅外熒光素)結(jié)合，由尾靜脈注入結(jié)腸癌裸鼠模型體內(nèi)，無創(chuàng)性活體熒光成像后可清晰反映腫瘤邊緣以及局部轉(zhuǎn)移灶。由此提示Claudin-1可作為近紅外抗體成像的有效靶點，用于腫瘤可視化，以便使用熒光引導進行手術(shù)治療。

人、豬和小鼠下頜下腺的腺泡細胞和導管細胞中都發(fā)現(xiàn)有Claudin-1表達。該蛋白主要分布于漿液性腺泡細胞膜，在黏液性腺泡細胞的頂外側(cè)膜上表達稍弱，此現(xiàn)象在人和豬的下頜下腺中較為相似。不同的是，小鼠下頜下腺的Claudin-1則主要分布于漿液性腺泡細胞的頂外側(cè)膜和基底外側(cè)膜上[16]，究其原因可能是嚙齒類動物的頜下腺腺泡細胞類型多數(shù)為漿液性。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠唾液腺分泌功能降低，阻斷白介素(interleukins，IL)-17受體可上調(diào)Claudin-1的表達水平，改善唾液分泌以及炎性細胞浸潤。

上述研究表明，Claudin-1不僅在唾液腺功能障礙中充當重要靶點，也是輔助診治良惡性腫瘤的有效工具。

2.2 Claudin-2

Claudin-2主要表達于膽囊、腎臟和胃腸道[12]。在硫酸魚精蛋白(protamine sulfate，PS)誘導的膀胱高滲性動物模型中，體內(nèi)分子靶向磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像顯示抗Claudin-2探針檢出率明顯高于假手術(shù)組[18]。由此可推測Claudin-2高表達與上皮通透性關(guān)系密切，并且Claudin-2抗體有望作為相關(guān)疾病分子標志物檢測上皮通透性變化。

人下頜下腺和腮腺組織免疫組化顯示Claudin-2分布于漿液性及黏液性腺泡細胞、夾層及橫紋導管細胞，但在內(nèi)皮細胞中并未發(fā)現(xiàn)[19]。然而，多項研究發(fā)現(xiàn)高糖水平、抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α治療并未對Claudin-2產(chǎn)生明顯影響[20-21]。

因此，Claudin-2在唾液腺功能的深層次機制仍需進一步探索。

2.3 Claudin-3

Claudin-3在胃腸道和一些腺體組織中表達[12]。與正常人相比，舍格倫綜合征患者唾液腺中Claudin-3表達水平均降低，分布位置也從根尖質(zhì)膜重新定位至基底外側(cè)膜[7]。

多項研究表明Claudin-3與細胞通透性直接相關(guān)。在糖尿病小鼠下頜下腺及高糖處理的SMG-C6細胞系中，Claudin-3表達水平顯著升高，細胞旁通透性降低，而基因敲除逆轉(zhuǎn)了以上表型[20]。同時，免疫熒光圖像顯示Claudin-3主要定位于腺泡頂外側(cè)和基底外側(cè)膜，且相較于野生型小鼠染色增強。然而，兩組小鼠的Claudin-3分布位置未見顯著差異[20]。此外，SMG-C6細胞的Claudin-3可被TNF-α通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2選擇性下調(diào)，跨上皮阻力下降，基因敲除改善了TNF-α導致的此種改變[22]。

此外，有研究表明小型豬副交感神經(jīng)切除2個月后，靜息唾液分泌量較對照組顯著減少，Claudin-3表達水平降低，6個月后Claudin-3表達水平及唾液量均恢復至正常水平[23]。以上結(jié)果提示Claudin-3在切除副交感神經(jīng)改善遠期唾液腺分泌功能方面同樣具有重要作用。

Claudin-3與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Claudin-3是已知人前列腺癌細胞(PC3)數(shù)據(jù)庫64種蛋白質(zhì)中得分最高的蛋白，使用免疫膠體金標記技術(shù)證實了Claudin-3作為PC3外泌體表面蛋白的確切屬性[24]。Martin等[25]發(fā)現(xiàn)高等級前列腺癌中Claudin-3表達水平更高，選取無毒截短的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素片段設(shè)計功能化納米顆粒，該靶向配體與Claudin-3受體有較強結(jié)合力，結(jié)合MRI成像可在體內(nèi)實現(xiàn)腫瘤特異性粒子定位、分辨腫瘤侵襲性等功能。

2.4 Claudin-4

Claudin-4表達于多種組織的細胞膜，其中在胃腸道中表達最廣泛[12]。哺乳動物下頜下腺的Claudin-4主要分布于導管上皮細胞外側(cè)膜和基底膜。盡管腺泡細胞也表達Claudin-4，但主要集中于漿液性腺泡細胞膜，黏液性細胞分布較少[16]。

課題組前期研究表明電離輻射導致大鼠下頜下腺分泌功能降低，Claudin-4表達水平呈時間依賴性和輻射劑量依賴性上調(diào)，M3受體水平呈現(xiàn)相反趨勢。缺血預(yù)處理和毛果蕓香堿治療后，Claudin-4表達水平降低，腺體分泌功能得到相應(yīng)改善[26-27]。然而，毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs)激活可通過ERK1/2下調(diào)Claudin-4，增加細胞旁通透性[28]。以上發(fā)現(xiàn)表明Claudin-4是mAChRs調(diào)節(jié)細胞旁通透性，從而改善唾液腺分泌功能所必需的。

對于唾液腺腫瘤，除黏液表皮樣癌組織中Claudin-4水平與非唾液腺腫瘤相同外，多數(shù)腫瘤導管上皮細胞的Claudin-4水平增加，如基底細胞腺瘤、多形性腺瘤等。除腺樣囊性癌外，Claudin-4熒光染色主要集中于腫瘤細胞膜，而非唾液腺腫瘤主要分布于緊密連接區(qū)[14]。此外，Claudin-4在胰腺癌中異常表達，注射[111In]Claudin-4抗體可利用單光子發(fā)射計算機斷層成像(single-photon emission computed tomography，SPECT)對體內(nèi)Claudin-4成像，作為早期檢測胰腺癌的生物標記物[29]。上述結(jié)果顯示，Claudin-4不僅有助于判斷唾液腺腫瘤類型，而且是預(yù)測非唾液腺腫瘤的重要工具。

2.5 Claudin-5

Claudin-5是腦內(nèi)皮細胞緊密連接的主要細胞黏附分子。敲除Claudin-5的小鼠由于血腦屏障嚴重受損，導致低于0.8 ku的示蹤劑滲漏至腦和脊髓實質(zhì)中，這些小鼠在出生后10 h內(nèi)死亡[30]。低氧狀態(tài)可誘導斑馬魚血腦屏障受損，免疫電鏡下發(fā)現(xiàn)Claudin-5被小窩蛋白包裹，從細胞膜分布到細胞質(zhì)并異常積聚。值得注意的是，自噬激活后對小窩蛋白的降解作用可抑制Claudin-5的異常改變，緩解了血腦屏障的損傷程度[31]。

在所有Claudin蛋白中，Claudin-5是許多類型內(nèi)皮細胞中表達最豐富的內(nèi)皮特異性封閉緊密連接成分[32]。舍格倫綜合征患者唇腺和雙側(cè)腮腺組織的Claudin-5水平較正常人升高，分布位置由內(nèi)皮細胞最頂端重新定位至內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)[33]。此外，糖尿病小鼠下頜下腺的Claudin-5表達模式同樣異常。7周齡時Claudin-5 mRNA水平增加不明顯，定位于相鄰內(nèi)皮細胞的最內(nèi)側(cè)。12周齡時Claudin-5表達于相鄰內(nèi)皮細胞側(cè)膜和細胞質(zhì)，其mRNA水平較對照組小鼠顯著上調(diào)，同時淋巴細胞浸潤及緊密連接寬度增加[33]。因此，炎性環(huán)境可能導致Claudin-5的表達和定位異常，從而出現(xiàn)緊密連接內(nèi)皮屏障破壞。

唾液腺黏液表皮樣癌的Claudin-5 mRNA水平顯著高于正常組，廣泛分布于腫瘤島表皮細胞的細胞質(zhì)和細胞膜，進一步分析發(fā)現(xiàn)Claudin-5的高表達水平對腫瘤的自我維持能力有一定程度的影響[34]。

2.6 Claudin-6

Claudin-6高表達于胎盤和睪丸[12]。過度表達Claudin-6的轉(zhuǎn)基因小鼠由于缺乏完整的表皮通透性屏障，跨表皮水分流失明顯增加，導致小鼠在出生后48 h內(nèi)死亡[35]。

小鼠下頜下腺Claudin-6主要在胚胎16 d表達于導管頂端并集中于緊密連接處，但在出生后幾乎完全消失[36]。上述結(jié)果與該分子在其他器官的胚胎特異性表達類似。Claudin-6定位于新生小鼠腎臟近端小管頂端細胞間連接處、升支粗段、遠端小管及集合管，表達水平隨年齡增加而下降，而成年小鼠腎臟幾乎檢測不到Claudin-6[37]。Zhao等[38]發(fā)現(xiàn)正常腎臟腎小球Claudin-6沿毛細血管壁分布，與ZO-1共定位。免疫電鏡顯示Claudin-6金顆粒主要積聚在基底細胞膜，少數(shù)分布于裂孔隔膜和緊密細胞連接處。PS灌注腎臟后，Claudin-6免疫金顆粒重新分布至足細胞足突間新形成的細胞接觸部位。由此可推斷Claudin-6是腎臟發(fā)育過程及病理條件下嚴重影響緊密連接的跨膜蛋白。

這些研究表明，Claudin-6可能在干細胞分化中有重要作用，未來應(yīng)探索Claudin-6在唾液腺發(fā)育的具體機制。

2.7 Claudin-7

Claudin-7蛋白表達于多數(shù)腺泡細胞，其mRNA在胃中高表達[12]。敲除Claudin-7的小鼠體內(nèi)鈉、氯和鉀離子嚴重流失，出現(xiàn)尿鹽消耗、脫水及生長緩慢，在出生后12 d死亡[39]。

激光共聚焦顯微鏡掃描創(chuàng)建三維圖像后顯示小鼠和人下頜下腺腺泡細胞的外側(cè)膜和基底膜可觀察到Claudin-7，但在豬下頜下腺的腺泡細胞中未檢測到。同Claudin-1和Claudin-4表達模式類似，Claudin-7定位于人、豬和小鼠下頜下腺導管細胞的外側(cè)膜和基底膜，不同的是，小鼠腺體導管細胞染色較腺泡細胞強烈[16]。

對于唾液腺腫瘤，Aoyama等[14]發(fā)現(xiàn)基底細胞腺癌和腺樣囊性癌導管上皮細胞的Claudin-7定位于緊密連接區(qū)和細胞膜，免疫反應(yīng)性明顯高于非腫瘤組織。對于唾液腺腫瘤的基底樣/肌上皮細胞細胞膜，Claudin-7在肌上皮瘤、沃辛瘤和肌上皮癌表達更顯著。因此，不同類型唾液腺腫瘤的Claudin-7定位差異有望作為判斷腫瘤類型的特異性標志。

2.8 Claudin-8

Claudin-8在哺乳動物的腎臟、前列腺、乳腺、膀胱、味蕾、骨骼肌和皮膚都有表達[40]。該蛋白主要定位于細胞膜，與細胞黏附的緊密連接關(guān)系密切。與正常人基因數(shù)據(jù)庫比較，口腔鱗狀細胞癌患者組織Claudin-8表達水平下調(diào)，表明Claudin-8可能具有抑癌作用。然而，Claudin-8高表達的口腔鱗狀細胞癌患者總體生存率較低，表明Claudin-8可能促進口腔鱗狀細胞癌的進展[41]。因此，Claudin-8在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的不同階段發(fā)揮的作用可能完全相反。盡管該蛋白可能作為口腔鱗狀細胞癌總體生存預(yù)后的標志物，但其在口腔鱗狀細胞癌中的作用亟需解釋。

目前，Claudin-8在小鼠、豬和人下頜下腺中被檢測到[16]，然而，需要進一步研究確定其在唾液腺中的功能。

2.9 Claudin-10

Claudin-10在多種組織中呈現(xiàn)高表達，例如唾液腺、腎小管、外分泌胰腺和膽囊[12]。研究表明Claudin-10序列變異與人類螺旋綜合征(少汗癥、電解質(zhì)失衡、淚腺功能障礙、魚鱗癥和口干癥)關(guān)系密切。Sewerin等[42]使用黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)分別標記Claudin-10a G163A與Claudin-10b G165A。發(fā)現(xiàn)Claudin-10a G163A與野生型(wild type，WT)共同定位于細胞間接觸部位。相反的是，Claudin-10b WT定位于細胞間接觸部位， Claudin-10b G165A則分布于相鄰細胞膜，表明Claudin-10b反式相互作用受到抑制。由此推斷， Claudin-10a G163A和Claudin-10b G165A雙等位基因突變，導致基于缺陷Claudin-10緊密連接鏈引起的螺旋綜合征變異，并且Claudin-10b受累更嚴重。

小鼠下頜下腺中Claudin-10在胚胎16 d及出生后明顯表達，主要定位于末端小管，與ZO-1共定位[36]。然而，糖尿病小鼠下頜下腺組織Claudin-10 表達水平與對照組相比未見明顯差異，腮腺組織中卻觀察到明顯下調(diào)[43]。同時，IgG4相關(guān)涎腺炎患者唾液分泌減少，下頜下腺Claudin-10 mRNA水平下調(diào)[44]。

綜上所述，Claudin-10在唾液、汗液和淚液分泌中發(fā)揮重要作用，并且在不同的唾液腺疾病及組織類型中表達水平有所差異，其中機制需進一步探索。

2.10 Claudin-11

Claudin-11大量表達于睪丸的支持細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細胞[12]，在多種屏障中發(fā)揮重要作用。Uchida等[45]發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化癥的血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)、血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)和血-蛛網(wǎng)膜屏障(blood-arachnoid barrier，BAB)中，Claudin-11蛋白表達水平顯著下調(diào)，降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮和上皮屏障的完整性。因此，預(yù)防Claudin-11下調(diào)可能作為治療多發(fā)性硬化癥的一種有效策略。

類似于Claudin-10的表達模式，Claudin-11可在胚胎16 d和出生后的小鼠下頜下腺末端小管表達。不同的是，該分子似乎也表達于鄰近末端小管的導管區(qū)域[36]。Cong等[46]發(fā)現(xiàn)兔下頜下腺自體移植后Claudin-11 mRNA表達下調(diào)，使用辣椒素可激活香草酸受體亞型1，Claudin-11 mRNA呈時間依賴性恢復，同時唾液流量顯著增加。因此，Claudin-11可能與唾液腺發(fā)育及屏障功能關(guān)系密切，確定該蛋白具體功能的研究很有必要。

2.11 Claudin-12

Claudin-12是非典型的Claudin蛋白[9]。Dias等[47]表明Claudin-12表達于小鼠多個器官，包括肝臟、心臟、腎臟、腸、骨骼肌、舌頭、視網(wǎng)膜和大腦。此外，炎癥刺激下未觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Claudin-12表達上調(diào)，其缺失不會損害血腦屏障的完整性及加重實驗性自身免疫性腦脊髓炎的程度。由此推斷Claudin-12對維持血腦屏障完整性不是必需的。

與健康小鼠相比，舍格倫綜合征小鼠下頜下腺中Claudin-12 mRNA表達上調(diào)[48]。相反的是，IgG4相關(guān)涎腺炎患者下頜下腺Claudin-12 mRNA顯著下調(diào)[44]。綜上所述，Claudin-12參與多種屏障組成，其表達模式在不同類型的涎腺疾病中也存在差異。因此，未來有必要了解Claudin-12在唾液腺中的作用。

2.12 Claudin-16

在人類大唾液腺中，Claudin-16表達于腺泡的基底外極和導管的頂端區(qū)，該蛋白在導管中的分布位置表明其在鈣和鎂轉(zhuǎn)運中起重要作用[49]。因此，需要進一步探索Claudin-16對導管功能的意義，以及確定其在腺泡中的潛在作用。

3 結(jié) 語

緊密連接蛋白Claudin亞型的表達模式和功能各有不同，不同的唾液腺疾病中也各有差異。本文介紹了唾液腺常見Claudin蛋白在放射性損傷、炎癥性疾病、舍格倫綜合征和糖尿病等多種病理狀況下的研究，未來應(yīng)探索該蛋白家族在不同疾病中的深層次機制。此外，Claudin蛋白不僅作為口腔及唾液腺腫瘤的生物標志物，還可特異性靶向標記如胰腺癌、結(jié)腸癌等其他器官腫瘤，實現(xiàn)腫瘤可視化，對腫瘤診斷、分型和預(yù)后等提供新思路，為實現(xiàn)個性化治療和精準治療闡明理論依據(jù)。