嚙齒類動(dòng)物種植體周圍炎模型構(gòu)建的研究進(jìn)展及應(yīng)用

戴雨薇，李 潔，孫媛元，吳軼群，孟 箭

種植體周圍炎是種植體周圍組織的病理狀態(tài)，以種植體周圍黏膜炎癥和支持骨的進(jìn)行性喪失為特征[1]。據(jù)報(bào)道，種植體十年累計(jì)生存率約為94.6%[2]，該生存率受種植體周圍炎的影響，且將隨著時(shí)間的推移而增加[3]。目前臨床上種植體周圍炎的治療沒(méi)有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和有效方案[4]，因此深入研究種植體周圍炎的發(fā)病機(jī)制、探索有效的治療方案尤為重要。

雖然非嚙齒類動(dòng)物模型已經(jīng)獲得了有價(jià)值的信息，但由于各種條件的限制，它們并不具備進(jìn)一步研究種植體周圍炎發(fā)病機(jī)制的優(yōu)勢(shì)。本文將對(duì)嚙齒類動(dòng)物種植體周圍炎動(dòng)物模型的構(gòu)建、研究進(jìn)展及應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 種植體周圍炎動(dòng)物模型構(gòu)建的概述

1.1 非嚙齒類動(dòng)物模型

種植體植入模型已經(jīng)成功地在不同的動(dòng)物物種中被構(gòu)建[5]。小型豬的牙周組織與人類的牙周組織有許多相似之處[6]，有研究人員利用豬來(lái)分析評(píng)價(jià)去皮瓣種植術(shù)后不同時(shí)間段種植體周圍骨的炎癥程度[7]。犬類也是較常用的動(dòng)物模型，性格溫順，且在人體使用的植入物可以在犬身上直接測(cè)試，Park等[8]利用犬評(píng)估即刻種植構(gòu)建周圍炎模型的有效性，同時(shí)測(cè)試再生療法治療種植體周圍炎的效果。兔也是研究牙周疾病炎癥基礎(chǔ)和愈合模式的常用模型。兔在相對(duì)較早的年齡就達(dá)到骨骼成熟，在進(jìn)行更多的繼發(fā)性骨重塑方面具有優(yōu)勢(shì)[9]。Sousa等[10]利用兔建立了鈦表面污染的種植體周圍炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，但兔在骨成分和骨重建方面與人類的相似性較小[11]，且兔模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段、技術(shù)相對(duì)受限。雖然非嚙齒類動(dòng)物牙齒的解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，但這些動(dòng)物模型同時(shí)也具有價(jià)格昂貴，需要專門的飼養(yǎng)和維護(hù)設(shè)施等顯著缺點(diǎn)。

1.2 嚙齒類動(dòng)物模型

與大型動(dòng)物模型相比，嚙齒動(dòng)物的飼養(yǎng)成本相對(duì)較低，且在炎癥過(guò)程中的相互作用方面已有了大量的研究數(shù)據(jù)[12]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者選擇嚙齒類動(dòng)物(主要是大鼠和小鼠)作為構(gòu)建種植體周圍炎的動(dòng)物模型，本文將對(duì)此展開闡述。

2 近年來(lái)研究中構(gòu)建的嚙齒類模型

2.1 嚙齒類動(dòng)物的品系

在種植體周圍炎嚙齒類動(dòng)物模型中C57BL/6J小鼠的應(yīng)用最為廣泛。Hiyari等[13]分別用C57BL/6J、C3H/HeJ、A/J型小鼠構(gòu)建模型，研究結(jié)果證明C57BL/6J小鼠在結(jié)扎組中骨丟失最多，其次是C3H/HeJ和A/J；在組織學(xué)上，C57BL/6J小鼠的中性粒細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量最多，且C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出最活躍的骨重建。在種植體周圍炎大鼠模型中常用的大鼠品系有SD、Wistar、Lewis等，其中SD大鼠與Wistar大鼠的應(yīng)用較為廣泛。

2.2 種植體設(shè)計(jì)

小鼠與大鼠在植入時(shí)需特制尺寸的種植體，小鼠微種植體的總長(zhǎng)度一般為1.0～1.7 mm，直徑一般為0.5～0.8 mm。大鼠微種植體的總長(zhǎng)度一般為2.0～4.5 mm，直徑一般為0.8～2.0 mm，目前尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)格，研究者們多根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行定制，主要包括圓柱形和錐形種植體，尺寸各異。

2.3 植入位點(diǎn)

在關(guān)于植入位點(diǎn)的研究中，大小鼠模型中以上頜第一磨牙作為植入位點(diǎn)較為普遍。在大鼠模型中，Shuto等[14]成功地在大鼠腭突建立種植體周圍炎模型，但也有相關(guān)研究表明大鼠腭部種植的成功率低于38.4%，不宜作為種植研究的位點(diǎn)[15]，因此結(jié)合文獻(xiàn)筆者認(rèn)為在大小鼠模型中，上頜第一磨牙具備較多的骨量及較大的操作空間，是較為合適的植入部位。

2.4 建模方案

目前已有多種方法用于在嚙齒類動(dòng)物模型中誘導(dǎo)種植體周圍炎，其中3種技術(shù)使用較廣泛：結(jié)扎法、脂多糖注射法及灌喂法。本文就嚙齒類動(dòng)物種植體周圍炎模型中所用的動(dòng)物種類、造模干預(yù)的方式、拔牙至種植體植入時(shí)的時(shí)間間隔、種植體植入至開始干預(yù)的時(shí)間間隔、干預(yù)的時(shí)間周期進(jìn)行歸納整理(表1)。并對(duì)目前的主流造模方法方式進(jìn)行總結(jié)，歸納出目前嚙齒類動(dòng)物模型造模流程圖(圖1)。

表1 嚙齒類動(dòng)物種植體周圍炎模型的建模方案Tab.1 Modeling scheme of peri-implantitis model in rodents

圖1 嚙齒類動(dòng)物種植體周圍炎模型的構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart of peri-implantitis model construction in rodents

2.4.1 結(jié)扎法 研究表明無(wú)菌鼠僅有局部刺激因素時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)種植體周圍炎的發(fā)生；同樣，普通環(huán)境的常規(guī)小鼠僅有微生物存在而無(wú)局部刺激的情況下，也不會(huì)誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。因此，誘導(dǎo)種植體周圍炎產(chǎn)生需要同時(shí)滿足上述兩個(gè)因素[37]。而利用結(jié)扎法在種植體周圍進(jìn)行絲線結(jié)扎可以打破種植體周圍黏膜的密封狀態(tài)，產(chǎn)生局部刺激性，同時(shí)促進(jìn)了黏膜下細(xì)菌生物膜的形成，繼而引發(fā)炎癥性破壞。結(jié)扎法通常在種植體植入并愈合后進(jìn)行，將5-0/6-0/7-0的絲線結(jié)扎在種植固定物頭部，以誘導(dǎo)種植體周圍炎的產(chǎn)生[23]。Nguyen Vo等[21]證明絲線結(jié)扎28 d可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)且伴隨著明顯的種植體周圍骨吸收。也有研究報(bào)道絲線結(jié)扎14 d即可以誘導(dǎo)小鼠種植體周圍炎的發(fā)生[25]，但是大多數(shù)學(xué)者仍然選擇第28天作為一個(gè)成熟的結(jié)扎模型[21，32-33]。

2.4.2 脂多糖注射法 注射牙齦卟啉單胞菌來(lái)源的脂多糖不僅會(huì)導(dǎo)致種植體周圍骨丟失，而且會(huì)導(dǎo)致種植體周圍軟組織的炎性變化[29]。利用脂多糖注射不需要等待菌斑的聚集及生長(zhǎng)過(guò)程，加快疾病進(jìn)程，一般在4周或6周即可建模完成。因此，它特別適合用于測(cè)試各種藥物對(duì)炎癥的治療效果以及其他疾病因素對(duì)炎癥的影響[35，38]。然而該模型的缺點(diǎn)是采用注射方式會(huì)對(duì)牙周組織造成一定的干擾，使用該模型時(shí)需要注意該方式本身帶來(lái)的影響。

2.4.3 灌喂法 灌喂法是也是誘導(dǎo)炎癥的一種方法，通過(guò)在體外培養(yǎng)外部病原體，如牙齦卟啉單胞菌、連翹坦納氏菌等，并通過(guò)灌喂法將其引入大鼠或小鼠的口腔[39]。研究人員對(duì)小鼠灌喂6周后成功觀察到口腔感染的發(fā)生[30-31]。與結(jié)扎及注射法相比，灌喂法所需要的時(shí)間相對(duì)增加，一般為6～12周。該技術(shù)的操作簡(jiǎn)便，技術(shù)難度較低，是可選擇的方式之一。

2.4.4 其他構(gòu)建方法 除了上述三種較為常見的誘導(dǎo)方法外，也有研究者提出多種誘導(dǎo)因素結(jié)合的聯(lián)合致病法。有研究報(bào)道指出，將浸有牙齦卟啉單胞菌的結(jié)扎絲置于小鼠齦下可誘導(dǎo)牙周炎的產(chǎn)生[40]。此方法也被應(yīng)用于種植體周圍炎小鼠模型的構(gòu)建，研究人員將浸有牙齦卟啉單胞菌的絲線結(jié)扎在種植體周圍，2周后骨吸收顯著增加，提示種植體周圍炎的形成[28]。此外Freire等[41]在種植體植入大鼠口腔之前在鈦植入物上建立了放線菌生物膜，并在植入后第7天和第6周依次觀察到種植體周圍黏膜炎和明顯的種植體周圍骨喪失，證明種植體周圍炎的發(fā)生。其他輔助誘導(dǎo)炎癥手段還包括高糖飲食，如Becker等[42]對(duì)小鼠種植體進(jìn)行結(jié)扎后同時(shí)輔以高糖飲食成功誘導(dǎo)種植體周圍炎的發(fā)生。李星佳等[43]也對(duì)大鼠種植體進(jìn)行絲線結(jié)扎配合糖水喂養(yǎng)，2周后與對(duì)照組相比種植體周中性粒細(xì)胞與牙齦中的白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)顯著增加且骨組織吸收明顯，提示造模成功。

2.5 造模成功的檢測(cè)方法

造模成功的檢測(cè)指標(biāo)主要包括臨床觀察、影像學(xué)和組織學(xué)三個(gè)方面。臨床觀察種植體周圍炎組牙齦組織可見明顯的紅腫、質(zhì)地變軟和滲出并伴有上頜牙齦皺褶丟失或破裂的明顯跡象。牙菌斑在種植體頸緣處積聚，且隨著炎癥進(jìn)展，出現(xiàn)自發(fā)性出血和軟組織增生[21]。由于種植體周圍炎的主要特征是種植體周骨丟失，因此在影像學(xué)方面表現(xiàn)為種植體頂端至牙槽嵴頂距離顯著增加，與炎癥誘導(dǎo)前相比，骨水平顯著下降[44]。在組織學(xué)評(píng)估方面，也可以觀察到種植體周的骨水平明顯降低，對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和基因表達(dá)分析，破骨細(xì)胞的存在也證實(shí)了種植體周圍出現(xiàn)了骨吸收[20]。同時(shí)在結(jié)締組織中可以觀察到大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，植入物周圍組織的炎癥前細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)明顯增加[21]。已知種植體周圍炎會(huì)發(fā)生基質(zhì)的降解和促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，因此誘導(dǎo)處理后的組織顯示出更多的基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)染色，也提示種植體周圍炎的存在[22]。

3 嚙齒類種植體周圍炎動(dòng)物模型的應(yīng)用

3.1 種植體周圍炎相關(guān)分子機(jī)制研究

通過(guò)建立基因敲除小鼠模型，可以對(duì)炎癥過(guò)程的相關(guān)分子、通路以及相互作用機(jī)制進(jìn)行更深入的探索。有研究者利用Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)基因敲除小鼠驗(yàn)證了TLR4通過(guò)調(diào)節(jié)免疫B細(xì)胞的浸潤(rùn)、核因子κB受體激活劑配體/護(hù)骨素(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/osteoprotegerin，RANKL/OPG)的表達(dá)比值和不同炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)結(jié)扎誘導(dǎo)的種植周炎小鼠的牙槽骨吸收[28]。Jung等[33]在結(jié)扎誘導(dǎo)種植體周圍炎的大鼠模型上，進(jìn)一步將含p65-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域(transmembrane domain，TMD)連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)的溶液注射入腭部種植體周，證明P65-TMD-PTD抑制了NF-κB的功能，進(jìn)而減少了大鼠種植體周圍炎部位的炎癥和骨吸收。Mori等[45]研究了在大鼠種植體周圍上皮中的Scgba1、LPO和GBP2基因，這些特征性表達(dá)與發(fā)生種植體周圍炎的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

3.2 種植體周圍炎與牙周炎以及其他系統(tǒng)性全身疾病相關(guān)性的探討

種植體周圍炎與牙周炎的關(guān)系一直以來(lái)受到學(xué)者們的熱議[46]。研究人員用嚙齒類動(dòng)物同時(shí)建立了牙周炎以及種植體周圍炎模型，結(jié)果表明與牙周炎相比，種植體周圍炎表現(xiàn)出更大的軟硬組織破壞[22]、種植體周圍炎對(duì)誘導(dǎo)因素去除后的恢復(fù)能力不如牙周炎[19]、抗原誘導(dǎo)的種植體周圍組織破壞比牙周組織破壞發(fā)生得更快[47]。此外，牙周炎與全身系統(tǒng)性疾病的相關(guān)性已經(jīng)得到了初步驗(yàn)證，種植體周圍炎與全身性系統(tǒng)疾病是否相關(guān)？在臨床上，已經(jīng)證明高血糖患者種植體周圍炎的發(fā)病率增高[48]，也有學(xué)者利用種植體周圍炎動(dòng)物模型研究口干癥、糖尿病以及血糖波動(dòng)等其他系統(tǒng)相關(guān)性疾病與種植體周圍炎的相關(guān)性[20，32，35]。

3.3 種植體周圍炎相關(guān)材料的應(yīng)用研究

Washio等[49]采用細(xì)胞片技術(shù)在鈦種植體周圍形成了牙周樣結(jié)構(gòu)，提高種植體周圍組織對(duì)感染的抵抗力；在研究新材料對(duì)種植效果的改善方面也有很多應(yīng)用，例如在大鼠皮下放置或植入新型材料驗(yàn)證激光改良型種植體與傳統(tǒng)種植體相比擁有更好的效果[50]、利用大鼠種植體周圍炎模型驗(yàn)證包裹牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival tissue-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)的黏附性水凝膠可以使發(fā)生種植體周圍骨丟失的病態(tài)牙種植體周圍形成完整的骨再生[51]、通過(guò)用納米顆粒介導(dǎo)PPARγ基因可產(chǎn)生促進(jìn)骨整合以及改善種植牙周炎的作用[52]。

4 嚙齒類動(dòng)物模型的局限性及展望

嚙齒動(dòng)物模型是探索感染引起的炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制背后分子機(jī)制的重要工具[39]。然而在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，關(guān)于種植體周圍炎動(dòng)物模型的構(gòu)建方法尚未統(tǒng)一，且有一定的局限性。首先由于結(jié)扎誘導(dǎo)技術(shù)產(chǎn)生的破壞是一種人為控制的侵入過(guò)程，結(jié)扎的類型、結(jié)扎的位置以及在菌斑形成期間更換結(jié)扎的頻率均影響炎癥的發(fā)生與發(fā)展，因此結(jié)扎誘導(dǎo)的組織破壞模型并不能作為概括種植體周圍的發(fā)病機(jī)制的理想模型[53]。而脂多糖注射法的主要缺點(diǎn)在于它需要在口腔中進(jìn)行多次注射操作且使用了免疫反應(yīng)刺激物——脂多糖作為炎癥的誘導(dǎo)劑，與種植體周圍炎的自然發(fā)展過(guò)程有一定差距。最后灌喂法雖不需要對(duì)植入部位進(jìn)行任何操作，但在實(shí)施過(guò)程中需要通過(guò)抗生素預(yù)處理和多次接種來(lái)抑制動(dòng)物本身存在的內(nèi)源性菌群，以促進(jìn)人源性致病菌的定植，且當(dāng)厭氧菌被引入口腔時(shí)必須在其不相容的齦上環(huán)境中定植和生存，對(duì)模型的構(gòu)建造成一定挑戰(zhàn)[54]。有研究表明將牙周炎患者的齦下菌斑經(jīng)實(shí)驗(yàn)室處理后涂抹在小鼠牙齒的結(jié)扎絲上，可以成功誘導(dǎo)牙周炎，同時(shí)使人牙周炎相關(guān)細(xì)菌有效定植，且菌種更加豐富，更為接近于牙周炎患者口腔環(huán)境[55]。因此筆者認(rèn)為將此方法應(yīng)用在種植體上，從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)物模型菌群人源化是一種模擬人體種植體周圍炎發(fā)展過(guò)程的有效方法。此外致病菌感染時(shí)選用多種菌群混合感染或許也可以更好地模擬人類口腔環(huán)境，縮小動(dòng)物模型與臨床研究的差異。除了造模方法本身的局限性，隨著人群健康的變化，針對(duì)不同系統(tǒng)性疾病存在時(shí)的種植體周圍炎的研究也對(duì)動(dòng)物模型的構(gòu)建提出更多要求，因此有必要探索更多存在相關(guān)系統(tǒng)性疾病的種植體周圍炎模型。

5 總 結(jié)

綜上所述，本文圍繞嚙齒類動(dòng)物模型在種植體周圍炎研究中的構(gòu)建方法及應(yīng)用展開介紹。種植體周圍炎動(dòng)物模型種類多，建模方案各異。雖然嚙齒類動(dòng)物模型具有實(shí)驗(yàn)周期較短、費(fèi)用低、體型小、飼養(yǎng)較易以及相關(guān)基因操作及試劑易獲得等其他動(dòng)物模型不可取代的優(yōu)勢(shì)，但它的局限性也十分顯著，如嚙齒類動(dòng)物微觀和宏觀結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度與人類存在差異，且體型的限制使實(shí)驗(yàn)對(duì)研究人員的操作要求較高。因此，研究者在進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，仍需綜合軟硬條件，合理選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀？傊?，嚙齒類動(dòng)物種植周圍炎模型為闡明促進(jìn)種植周圍炎進(jìn)展的影響因素提供了有用的工具，而更好地理解種植體周圍炎的發(fā)病機(jī)制則有望為新的治療策略指明方向。