葡萄田間愈傷組織誘導(dǎo)研究

姜英，姜福莉，趙紫蝶，王娜，秦子禹

（河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北秦皇島 066004）

果樹(shù)多倍體通常表現(xiàn)出樹(shù)壯、抗病、豐產(chǎn)、果大、無(wú)籽或少籽等優(yōu)異性狀，多倍體育種己成為果樹(shù)品種改良的重要途徑。相對(duì)于蘋(píng)果、梨、桃等二倍體較大果型水果，多倍體葡萄的大果粒、無(wú)籽或少籽的優(yōu)點(diǎn)顯得更為突出，因此葡萄多倍體育種也成為其種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑。多年來(lái)雜交育種是葡萄多倍體育種的常規(guī)方法[2]，目前育成的多倍體葡萄品種約有68%為雜交方法育成[3]。人工誘變創(chuàng)造多倍體相對(duì)于傳統(tǒng)雜交育種具有時(shí)期短的優(yōu)點(diǎn)，但傳統(tǒng)的田間莖尖多倍體誘變，嵌合現(xiàn)象嚴(yán)重，純化過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，組培條件下的多倍體誘變則存在進(jìn)入田間評(píng)價(jià)需時(shí)較長(zhǎng)等問(wèn)題。因此田間誘導(dǎo)愈傷組織獲得純合多倍體成為一項(xiàng)更為理想的技術(shù)方法，不僅可以快速誘導(dǎo)獲得純合多倍體，而且加倍的不定芽當(dāng)年可發(fā)育形成木質(zhì)化枝條，用于嫁接擴(kuò)繁，可大大縮短多倍體育種周期，同時(shí)還可徹底解決嵌合體純化難題[4]。

目前，在棗樹(shù)、榆樹(shù)、海棠、五角楓、石榴等植物中已成功建立田間愈傷組織途徑免嵌合體純化多倍體誘導(dǎo)[5-7]。在葡萄上，誘導(dǎo)愈傷組織大多是在離體條件下進(jìn)行，并未進(jìn)行田間多倍體誘導(dǎo)[8-17]。吳紅等[18]用‘維多利亞’葡萄試管苗單芽莖段誘導(dǎo)得到四倍體；集賢等[19]利用‘優(yōu)無(wú)核’葡萄組培苗的不同芽位獲得多倍體；王敏琴等[20]報(bào)道了離體條件下誘導(dǎo)葡萄花藥、花絲產(chǎn)生愈傷組織，并利用秋水仙素溶液處理胚狀體及幼苗，獲得葡萄多倍體試管苗；楊曉明[21]利用莖段和葉片為外植體產(chǎn)生愈傷組織，并用秋水仙素溶液處理腋芽獲得多倍體。但這些報(bào)道大都是嵌合體，需進(jìn)一步純化才能獲得純合多倍體。

目前，葡萄田間愈傷組織誘導(dǎo)多倍體鮮有報(bào)道。因此，本文以葡萄嫩枝為試材，研究了田間條件下包裹方式、激素等因素對(duì)葡萄新梢愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為下一步從愈傷組織誘導(dǎo)葡萄多倍體或進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本試驗(yàn)在河北科技師范學(xué)院園藝園林實(shí)驗(yàn)站葡萄育種基地和昌黎縣施各莊葡萄育種基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)共設(shè)置7種處理方式，其中包裹方法、噻苯?。═DZ）、硝酸銀（AgNO3）、短截時(shí)期、新梢粗度、短截部位的研究均用‘巨峰’葡萄為材料，基因型處理用‘巨峰’‘赤霞珠’‘溫克’‘A-09’葡萄為材料。樹(shù)齡均為7年生，避雨棚籬架栽培，常規(guī)管理模式。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2021年5—8月，將葡萄新梢短截后用脫脂棉覆蓋截面，用膠頭滴管滴加激素，以浸濕脫脂棉為宜，一般需要滴加2～3 mL，最后進(jìn)行包裹。

1.3.1 包裹方式對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截后，在截面覆上脫脂棉滴加激素TDZ（8.0 mg·L-1）和硝酸銀（2.0 mg·L-1）。新梢截面采用3種方式進(jìn)行包裹，方式1（黑袋）、方式2（黑袋+濕泥+黑袋）、方式3（濕泥+黑袋）。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況，找出截面最佳包裹方式。在以下處理中均采用最佳包裹方式。

1.3.2 TDZ對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

在新梢截面形成層滴加不同濃度的TDZ（4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1）+AgNO32.0 mg·L-1。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.3.3 AgNO3對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截后在截面形成層滴加AgNO3（2.0、4.0、6.0 mg·L-1）+TDZ 10.0 mg·L-1。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.3.4 短截時(shí)期對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

分別在5月底、6月底和7月底將新梢短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后進(jìn)行包裹。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.3.5 新梢粗度對(duì)截面愈傷組織的影響

分別將直徑為0.6、1.0、1.2 cm的新梢進(jìn)行短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進(jìn)行包裹。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.3.6 短截部位對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

新梢短截部位分別在節(jié)間與節(jié)部，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進(jìn)行包裹。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.3.7 基因型對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

以‘巨峰’‘赤霞珠’‘溫克’‘A-09’為試材，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后進(jìn)行包裹。每個(gè)處理短截新梢10個(gè)，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率與愈傷組織等級(jí)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

新梢截面愈傷組織誘導(dǎo)量的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[22]并稍做修改，如下：

0：無(wú)愈傷組織；+：木質(zhì)部和韌皮部之間可見(jiàn)愈傷組織；++：愈傷組織超出形成層，愈傷組織環(huán)更加明顯；+++：愈傷組織環(huán)繼續(xù)加粗，寬度約占截面半徑的1/5～1/2；++++：愈傷組織環(huán)約達(dá)截面半徑的1/2；+++++：愈傷組織環(huán)超過(guò)截面半徑的1/2；++++++：愈傷組織呈蘑菇狀溢出。

新梢愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=截面出愈傷新梢數(shù)/短截總新梢數(shù)×100

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，用不同字母表示其差異顯著性，大寫(xiě)字母為（P<0.01），小寫(xiě)字母（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 包裹方式對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

如表1所示，方式1和方式2覆蓋后新梢截面愈傷誘導(dǎo)率最高達(dá)67%和73%，方式3的愈傷誘導(dǎo)率最低為50%。其中方式1的田間操作不僅包裹省時(shí)，還省去了濕泥的繁瑣，但是方式2的愈傷在顏色和質(zhì)地方面好于方式1，且誘導(dǎo)率和愈傷組織等級(jí)都高于方式1。

表1 包裹方式對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 1 Effect of wrapping method on callus of new shoot section

2.2 TDZ和AgNO3對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

由表2可以看出，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著TDZ濃度的增加而增加，濃度在4.0 mg·L-1和6.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率最低，僅為30%；在TDZ 10.0 mg·L-1和12.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率最高，達(dá)80%。但TDZ 10.0 mg·L-1的愈傷組織等級(jí)大于12.0 mg·L-1。所以本研究以TDZ10.0 mg·L-1為最佳截面愈傷組織誘導(dǎo)濃度。

表2 不同濃度的TDZ和AgNO3對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 2 Different concentration of TDZ and AgNO3 on the callus of new shoot section

葡萄新梢短截后，在TDZ 10.0 mg·L-1附加AgNO3各濃度對(duì)截面愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響。由表2可以看出，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著AgNO3濃度的增加而降低，AgNO3濃度為6.0 mg·L-1時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最低，為47%；在AgNO32.0 mg·L-1時(shí)的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)到80%，且愈傷組織等級(jí)和誘導(dǎo)率都顯著高于其它兩個(gè)濃度。所以以TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1為最佳截面愈傷組織誘導(dǎo)濃度。

2.3 短截時(shí)期對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

由表3可以看出，5月下旬的愈傷誘導(dǎo)率最低，達(dá)50%；7月下旬的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)90%。

表3 短截時(shí)期對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 3 Effects of short cut period on the callus of new shoot section

2.4 新梢粗度對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

由表4可知，在新梢粗度1.0～1.2 cm時(shí)，新梢截面的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)87%；新梢粗度1.0 cm以上時(shí)，新梢截面愈傷組織誘導(dǎo)率效果好；新梢粗度0.6 cm以下時(shí)，新梢截面愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為33%。這是由于新梢粗度不同，木質(zhì)化程度不同，新梢越粗，形成層越寬，可形成的愈傷組織環(huán)就越寬，更利于愈傷組織的形成。

表4 新梢粗度對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 4 Effect of shoot thickness on callus of shoot section

2.5 短截部位對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

由表5可知，節(jié)間和節(jié)部愈傷組織誘導(dǎo)率接近，為90%左右。在新梢節(jié)部營(yíng)養(yǎng)豐富，易于愈傷組織形成，但是節(jié)部芽點(diǎn)較多，誘導(dǎo)后易于形成嵌合體，所以節(jié)間為最佳部位。

表5 短截部位對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 5 Effect of short section on callus of new shoot section

2.6 基因型對(duì)新梢截面愈傷組織的影響

利用前面篩選的最佳包裹方式、激素組合、新梢粗度等處理，對(duì)4個(gè)葡萄基因型新梢進(jìn)行截面誘導(dǎo)，所有基因型均成功誘導(dǎo)出愈傷組織。如表6所示，‘巨峰’和‘赤霞珠’的愈傷組織誘導(dǎo)率和等級(jí)都顯著高于其它兩個(gè)基因型，愈傷組織等級(jí)達(dá)到6級(jí)，其它兩個(gè)基因型愈傷組織等級(jí)為4級(jí)?！薹濉汀嘞贾椤T導(dǎo)率最高，達(dá)87%?！疁乜恕恼T導(dǎo)率最低，為60%。

表6 基因型對(duì)新梢截面愈傷組織的影響Table 6 Induction of callus from new shoot sections of different grape varieties

3 討論

以往研究中，棗樹(shù)、榆樹(shù)、海棠、五角楓、石榴等植物中已成功建立田間愈傷組織途徑，這些植物一般選擇在多年生枝干截枝誘導(dǎo)愈傷組織。本科研團(tuán)隊(duì)多年來(lái)在葡萄多年生枝蔓進(jìn)行了截枝預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果樹(shù)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的整株死亡現(xiàn)象，這些都使葡萄田間誘導(dǎo)愈傷組織的難度加大。因此選擇對(duì)葡萄新梢進(jìn)行截枝，很大程度減少了對(duì)樹(shù)體的傷害，同時(shí)利用不同包裹方式和激素組合成功誘導(dǎo)出了愈傷組織。

從愈傷組織存在部位和形態(tài)來(lái)看，其主要源于木質(zhì)部和韌皮部之間的形成層。新梢被短截后裸露的截面極易風(fēng)干，愈傷組織難以形成。因此，為得到新梢截面愈傷組織，采取覆蓋措施保護(hù)截面并搭配適宜的激素組合就顯得非常重要。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3種覆蓋方式中，由于葡萄新梢田間條件下愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，最短也要15 d以上，所以包裹材料選用黑塑料袋和濕泥，以遮陰保濕為主要目的。就目前田間試驗(yàn)情況來(lái)看，濕泥直接覆蓋截面，可以降低溫度，減少酚類(lèi)化合物的合成，減少褐化，但因濕泥中混有雜菌，形成層直接接觸后極易霉變。所以本試驗(yàn)對(duì)新梢截面采用了（黑塑料袋+濕泥+黑塑料袋）的三重長(zhǎng)效保濕方式，第一層的黑袋起到了隔離截面雜菌的作用，第二層濕泥和第三層黑袋起到長(zhǎng)久保濕的作用，利用該方法在葡萄新梢獲得了最佳愈傷組織誘導(dǎo)率。

另外，愈傷組織的獲得一般是將成熟的體細(xì)胞“逆轉(zhuǎn)”到分化程度較低的狀態(tài)并恢復(fù)其增殖能力，其中正常細(xì)胞的多少直接影響其分化與再生能力，獲得的愈傷組織遺傳性狀比較穩(wěn)定[23-25]。激素濃度、新梢粗度、短截部位等均對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響，本試驗(yàn)采用TDZ復(fù)合AgNO3處理誘導(dǎo)愈傷效果顯著，最適宜的TDZ濃度為10.0 mg·L-1。AgNO3濃度的升高反而對(duì)愈傷誘導(dǎo)存在抑制作用，適宜的AgNO3濃度為2.0 mg·L-1，這與前人棗樹(shù)研究結(jié)果一致[26]。6—7月愈傷組織誘導(dǎo)率顯著大于5月，可能與溫度有關(guān)，昌黎地區(qū)5月底平均氣溫為20 ℃，低于7月底均溫27 ℃。彭向永等[27]研究表明，適宜愈傷組織產(chǎn)生的溫度范圍為25～28 ℃，低于或高于此溫度范圍時(shí)愈傷組織發(fā)生率均降低，這與本研究的結(jié)果一致。葡萄新梢比較細(xì)嫩，新梢越粗，愈傷誘導(dǎo)效果越好，但是過(guò)粗的新梢意味著更大的髓部，不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，因此適宜的新梢粗度為1.0～1.2 cm。節(jié)間和節(jié)部的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著，愈傷組織等級(jí)有明顯差異，但是葡萄節(jié)部營(yíng)養(yǎng)豐富，在后期芽的再生中易出現(xiàn)嵌合體，不能達(dá)到理想效果，所以節(jié)間為最佳部位。

芽的再生體系可通過(guò)田間和離體的方式獲得。到目前為止，葡萄芽再生研究基本都是在離體條件下進(jìn)行[28-29]。但離體培養(yǎng)需無(wú)菌條件、人為補(bǔ)充光照，并且操作繁瑣、技術(shù)要求高、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，獲得的組培苗生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入開(kāi)花結(jié)果耗時(shí)較長(zhǎng)[30]。而田間條件下樹(shù)體再生系數(shù)高，生長(zhǎng)較快，再生芽當(dāng)年可發(fā)育為木質(zhì)化枝條，并能開(kāi)花結(jié)果，誘變后易獲得純合體[31]。本試驗(yàn)探究出了適于葡萄田間條件下直接誘導(dǎo)愈傷組織的最佳包裹方式和激素組合，且誘導(dǎo)的愈傷組織等級(jí)達(dá)到六級(jí)，為下一步從愈傷組織誘導(dǎo)出芽進(jìn)而誘導(dǎo)同源多倍體奠定基礎(chǔ)，對(duì)于多倍體葡萄育種具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究對(duì)葡萄進(jìn)行了田間條件下直接誘導(dǎo)愈傷組織，7月底對(duì)直徑1 cm以上的葡萄新梢在節(jié)間進(jìn)行短截，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后，采用黑袋+濕泥+黑袋的三重長(zhǎng)效保濕方式進(jìn)行覆蓋包裹，葡萄新梢愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)90%。4個(gè)基因型中以‘巨峰’‘赤霞珠’誘導(dǎo)率較高，達(dá)87%。