青皮的高效液相特征圖譜和5個黃酮類成分含量測定

肖小春，何小芳，張英，吳孟華，曹暉，馬志國*（. 無限極（中國）有限公司研發(fā)中心，廣州 5040；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 52400；3. 暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心，廣州 5400；4. 廣東省中醫(yī)藥信息化重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州 5400）

青皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮；5～6月收集自落的幼果，曬干，習(xí)稱“個青皮”；7～8月采收未成熟的果實(shí)，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓤瓣，曬干，習(xí)稱“四花青皮”。青皮具有疏肝破氣，消積化滯的功效；用于胸脅脹痛，疝氣疼痛，乳癖，乳癰，食積氣滯，脘腹脹痛[1]。青皮中含有揮發(fā)油、黃酮類、氨基酸、胺類、生物堿、有機(jī)酸等成分[2]，其中以橙皮苷、橘皮素、川陳皮素等為代表的黃酮類成分是青皮的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3-4]。2020年版《中國藥典》一部中青皮以橙皮苷為含量測定指標(biāo)[1]，有研究采用UPLC、HPLC對青皮中的橙皮苷、柚皮素、橘皮素、川陳皮素等成分進(jìn)行定量分析[5-9]。關(guān)于青皮的HPLC特征圖譜也有文獻(xiàn)報道，但分析時間過長，且各峰分離度仍需改善[10-12]。目前尚未見到同時測定蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素5個黃酮類成分的方法報道。本研究采用HPLC建立青皮的特征圖譜，并同時測定其中5個黃酮類成分的含量，以期為青皮的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo UlitMate 3000型高效液相色譜儀，DAD檢測器，在線真空脫氣機(jī)，自動進(jìn)樣器，柱溫箱（美國賽默飛公司）；XSR105/A十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多）；FA 2204B 萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ單列兩孔恒溫水浴鍋（TAISITE儀器有限公司）；YF-高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精其儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品蕓香柚皮苷（批號：X-080-181219）、橙皮苷（批號：Y-071-180917）、香蜂草苷（批號：X-010-171216）、川陳皮素（批號：Y-006-171216）、橘皮素（批號：G-019-171216）（成都瑞芬思生物科技有限公司，含量均大于98.0%）。乙腈（上海麥克林生化科技有限公司）、甲酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）均為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為市售分析純。

共收集24批四花青皮藥材，經(jīng)暨南大學(xué)嶺南傳統(tǒng)中藥研究中心馬志國教授鑒定為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的未成熟果實(shí)的果皮。樣品信息見表1。

表1 四花青皮樣品信息Tab 1 Sample information of Sihuaqingpi

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取蕓香柚皮苷對照品2.24 mg、香蜂草苷對照品1.68 mg分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液A、B；分別精密稱取川陳皮素對照品1.81 mg、橘皮素對照品1.29 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液C；精密稱取橙皮苷對照品5.74 mg置20 mL量瓶中，精密加入對照品溶液A 4 mL、B 2 mL、C 2 mL，超聲使溶解，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成含蕓香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素、橙皮苷5個對照品成分質(zhì)量濃度分別為44.80、16.80、7.24、5.16、287.00 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥樣品粉末0.2 g（過80目篩），精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定重量，超聲處理（功率700 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～15 min，15%～20%A；15～20 min，20%～25%A；20～30 min，25%～40%A）；流速1.0 mL·min-1，特征圖譜檢測波長為295 nm，含量測定檢測波長為283 nm和330 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 特征圖譜研究

2.3.1 精密度考察 取同一供試品溶液（SHQP-01），連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。以川陳皮素（4號峰）為參照峰，計算得各色譜峰的相對保留時間的RSD均＜0.12%，相對峰面積RSD均＜3.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液（SHQP-01），分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，分別記錄色譜圖。以川陳皮素（4號峰）為參照峰，計算得各色譜峰的相對保留時間的RSD均＜0.14%，相對峰面積RSD均＜3.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取同一批四花青皮（SHQP-01）樣品粉末（過80目篩），按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以川陳皮素（4號峰）為參照峰，計算得各色譜峰的相對保留時間RSD均＜0.11%，相對峰面積RSD均＜3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 四花青皮特征圖譜的建立 取24批樣品粉末，按“2.1.2”項下方法制備，進(jìn)樣檢測，獲得特征圖譜，以4號峰為參照，共確定了5個特征峰，導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012 版）”（見圖1），采用平均值法生成對照特征圖譜（見圖2），計算得到24批樣品與對照特征圖譜的相似度均大于0.95，表明各批次樣品之間化學(xué)成分基本一致。

圖1 24批四花青皮藥材樣品HPLC色譜圖譜疊加圖Fig 1 HPLC chromatogram of 24 batches of Sihuaqingpi

圖2 四花青皮HPLC特征圖譜共有模式圖Fig 2 HPLC specific chromatogram of Sihuaqingpi

根據(jù)表2中24批四花青皮藥材樣品的特征圖譜測定結(jié)果，峰1～5的相對保留時間范圍均符合小于平均值±5%的限度要求，且RSD均＜1.00%，故以峰1～5作為青皮藥材的特征峰。以4號峰為參照峰，分別計算各特征峰的相對保留時間，結(jié)果各特征峰的相對保留時間值分別為峰 1（0.410）、峰 2（0.437）、峰 3（0.554）、峰 4（1.000）、峰 5（1.202），其相對保留時間應(yīng)在制訂值的±5%之內(nèi)，積分參數(shù)斜率靈敏度為10，峰寬為0.1，最小峰面積為2。

表2 24批四花青皮藥材樣品特征圖譜中5個特征峰相對保留時間Tab 2 Relative retention time of 5 peaks in 24 batches of Sihuaqingpi samples

2.4 青皮中5個黃酮類成分的含量測定

2.4.1 色譜測定 按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行檢測，在該色譜條件下，5個黃酮類成分分離度良好，混合對照品及樣品色譜圖見圖3。

圖3 青皮藥材的HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of Sihuaqingpi

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液10、5、2.5、0.5、0.25 mL，分別置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度（x，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab 3 Regressive equation，correlation coefficient and linearity

2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液（蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素，質(zhì)量濃度分別為44.80、287.00、16.80、7.24、5.16 μg·mL-1），連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得5個成分的峰面積RSD均＜3.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取取同一供試品溶液（SHQP-01），分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行測定，結(jié)果供試品溶液中5個成分的峰面積RSD均＜2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取四花青皮樣品（SHQP-01）粉末（過80目篩）6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備，進(jìn)樣測定，結(jié)果樣品中蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素平均含量分別為10.16、121.50、3.67、3.63、2.21 mg·mL-1，RSD均＜2.9%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含量的四花青皮（SHQP-01）粉末（過80目篩）約0.1 g，共6份，精密稱定，置50 mL量瓶中，每份分別精密加入橙皮苷對照品溶液（1.26 mg·mL-1）10 mL，蕓香柚皮苷（0.492 mg·mL-1）對照品溶液2 mL、香蜂草苷（0.356 mg·mL-1）、川陳皮素（0.360 mg·mL-1）、橘皮素（0.242 mg·mL-1）對照品溶液各1 mL，再加甲醇稀釋至刻度，按“2.1.2”項下方法制備，進(jìn)樣測定，計算平均回收率，結(jié)果蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素的平均加樣回收率（n＝6）分別為101.12%（RSD＝2.7%）、100.41%（RSD＝0.91%）、99.11%（RSD＝1.4%）、100.32%（RSD＝2.6%）、98.62%（RSD＝2.4%），表明方法回收率良好。

2.4.7 樣品測定 分別取24批四花青皮藥材粉末（過80目篩）各2份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液 10 μL，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，用外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表4。5個成分中，橙皮苷含量最高，為12.7%，約占5個成分總量的87.6%，且不同產(chǎn)地間的含量差異最小。香蜂草苷平均含量最低，為0.285%，含量范圍為0.130%～0.507%，其中四川南充產(chǎn)的3批樣品（SHQP-22、SHQP-23、SHQP-24）含量明顯高于平均值。蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素3個成分的含量呈現(xiàn)明顯的產(chǎn)地差異性，四川產(chǎn)的4批樣品（SHQP-1、SHQP-22、SHQP-23、SHQP-24）中蕓香柚皮苷顯著高于其他省份，而川陳皮素和橘皮素顯著低于其他省份。

表4 四花青皮中5個成分含量測定結(jié)果(%，n＝2)Tab 4 Contents of 5 components in Sihuaqingpi (%，n＝2)

3 討論

3.1 黃酮類成分含量

由試驗結(jié)果可知，不同批次的青皮樣品中各測定成分含量均有不同程度的差異，但橙皮苷和香蜂草苷差異相對較小，而蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素含量差異與產(chǎn)地密切相關(guān)，四川產(chǎn)的4批樣品與浙江、江西產(chǎn)的樣品差異顯著，可能與不同省份栽培品種不同有關(guān)。此外，文獻(xiàn)報道，青皮生長發(fā)育期間，其中物質(zhì)形成不是簡單地從少到多，而是隨生長成熟，有的成分在減少，有的成分在增加，表明采收期不同會影響青皮中黃酮類成分的含量[10]，四花青皮中5種成分含量的差異可能與采收期不同有關(guān)[3]。因此，加強(qiáng)青皮藥材的規(guī)范化種植和產(chǎn)地加工的規(guī)范化、完善青皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對保證青皮藥材質(zhì)量具有重要意義。

3.2 提取方法的優(yōu)選

本試驗對供試品溶液制備的提取方法、提取溶劑、提取時間分別進(jìn)行了優(yōu)選。首先進(jìn)行提取方法（超聲、回流）考察，發(fā)現(xiàn)在相同的提取時間超聲提取法提取率普遍高于回流法；對提取溶劑（50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取率最高；對比了不同超聲時間（20、30、40 min）對提取率的影響，結(jié)果超聲30 min提取率最好。

3.3 檢測波長的選擇

采用DAD檢測器觀察190～370 nm下各特征峰的信號高低，最終選擇295 nm作為特征圖譜的測定波長，在此波長下各特征峰均有較好的信號強(qiáng)度。因5個成分的最大吸收波長不同，蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷最佳測定波長為283 nm，而川陳皮素、橘皮素最佳吸收波長為330 nm，因此選擇283 nm和330 nm兩個測定波長。

3.4 小結(jié)

本試驗建立了青皮飲片的特征圖譜，并同時測定了不同批次青皮中蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陳皮素、橘皮素5個黃酮類成分的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確，具備定性定量雙重作用，為有效控制青皮飲片質(zhì)量提供了研究基礎(chǔ)。