克班寧對肝癌細胞增殖和凋亡的影響

譚佳杰，向玉玲，熊遠果，張洪（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為世界上最常見的癌癥之一，常由包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、過量飲酒、非酒精性脂肪肝在內(nèi)的各種風(fēng)險因素導(dǎo)致[1-2]。其常見的治療方法包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融和經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)，其中晚期肝癌患者的臨床療效和預(yù)后非常差，迫切需要更有效的治療藥物[3-4]。

克班寧（crebanine）作為一種阿樸啡類異喹啉生物堿，存在于防己科千金藤屬（Stephania Lour）植物中，多來自其中的千金藤亞屬（Subgen. Stephania）和山烏龜亞屬（Subgen. Tuberiphania）[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在云南地不容中，阿樸啡型和原小檗堿型生物堿最多，其中克班寧是含量最高的阿樸啡型化合物之一[6]。迄今為止，對于克班寧的性質(zhì)結(jié)構(gòu)已有了一定的探索結(jié)果[7-9]，且發(fā)現(xiàn)它具有抗心律失常等多種藥理活性[10-13]。同時，已有多個研究證明克班寧能有效抑制白血病、纖維肉瘤、宮頸癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤細胞的活性[14-17]。Yodkeeree等[18]發(fā)現(xiàn)克班寧能通過下調(diào)侵襲遷移相關(guān)因子的表達來抑制肺癌的遷移和侵襲，另外Wongsirisin等[19]還發(fā)現(xiàn)克班寧作用于HL-60細胞后，能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白來介導(dǎo)細胞凋亡。

但關(guān)于克班寧對肝癌的生物學(xué)影響，目前還未見更深入的報道，因此，本研究的目的在于探索克班寧對肝癌生物學(xué)方面的影響，從而為未來開發(fā)克班寧在肝癌方向的治療作用提供一定的參考，并奠定相應(yīng)的研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

克班寧（分子式：C20H21NO4，純度≥ 98%，規(guī)格：20 mg，批號：RFS-K02811812016，成都瑞芬思生物科技有限公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1）；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：8120360）、胎牛血清（批號：20012050）（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（批號：C0038，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Hoechst 33258染色試劑盒（批號：G1011）、PBS（批號：G4202）（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒（批號：8086787，美國BD公司）；FoxO3a抗體（批號：10849-1-AP）、p-AKT抗體（批號：28731-1-AP）、p-FoxO3a抗體（批號：28755-1-AP）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；BAX抗體（批號：5023S）、Bcl-2抗體（批號：3498S）、PARP抗體（批號：9532S）、AKT抗體（批號：9272S）、β-actin抗體（批號：4970S）、二抗antirabbit IgG（H+L）（批號：5151S）（美國CST公司）。

圖1 克班寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of crebanine

1.2 儀器

HERAcell 160i二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo）；TC20細胞計數(shù)儀（美國BIO-RAD）；EnSight酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer）；CytoFlex流式細胞儀（美國Beckman Coulter）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）；DYY-7C蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國Li-COR）。

1.3 細胞和培養(yǎng)

人肝癌細胞系Huh7（中國科學(xué)院上海細胞生物研究所），采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液傳代。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細胞存活率

將Huh7細胞以每孔1×104個接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，按照0（對照組）、12、36、48、60、96 μg·mL-1的分組分別給予克班寧，每個質(zhì)量濃度6個復(fù)孔，然后繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，待24、48和72 h后，在每孔中加入10 μL CCK-8工作液，在 450 nm波長下測定各孔的吸光度值。細胞存活率（%）＝（給藥組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）×100%。

2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期的Huh7細胞，以每孔4×106個接種于6孔板中，待培養(yǎng)24 h后給予不同質(zhì)量濃度的克班寧[0（對照組）、36、48、60 μg·mL-1]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入1 mL DMEM后在倒置顯微鏡下觀察肝癌細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，并拍照記錄。

2.3 克隆形成實驗

將Huh7細胞以每孔4×103個接種到6孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，給予克班寧，在24 h后棄去培養(yǎng)基，重新加入新鮮培養(yǎng)基，待14 d后用PBS清洗2次，并以4%多聚甲醛固定20 min，之后用0.5%結(jié)晶紫染色，30 min后清洗并晾干，同時拍照記錄。細胞數(shù)＞30個為一個集落，克隆形成率（%）＝每組的克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

2.4 Hoechst 33258實驗

細胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項下，給藥24 h后用PBS清洗2次，再用4%多聚甲醛固定20 min，加入Hoechst 33258工作液避光孵育30 min，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

細胞收集、種板、給藥方法同“2.2”項下，給藥24 h后，收集培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用無EDTA胰酶消化，1000×g離心5 min，再次用PBS清洗2次，每組加入100 μL緩沖液、5 μL AnnexinⅤ-FITC及5 μL PI，避光孵育25 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6 Western blot實驗

將對數(shù)生長期的Huh7細胞以每孔7×106個接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后給予克班寧，再孵育24 h后，提取蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。將蛋白上樣后進行SDS-PAGE凝膠電泳，2 h后恒流進行電轉(zhuǎn)，之后用5%的BSA封閉1.5 h，加TBST清洗，然后用相應(yīng)一抗在4℃條件下孵育過夜；再次用TBST清洗，之后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）孵育2 h，同樣用TBST清洗，最后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描目的條帶。掃描結(jié)果用Image J軟件測定灰度值，最后目的蛋白的相對表達量＝目的蛋白的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析和圖片制作，數(shù)據(jù)以x±s表示，3組及以上數(shù)據(jù)組間差異評估采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各實驗至少重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 克班寧對肝癌Huh7細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果見圖2，與對照組相比，隨著給藥濃度增加（0、12、36、48、60、96 μg·mL-1）Huh7細胞的增殖活性逐漸降低，且細胞的存活率隨著時間的增長（24、48、72 h）也顯著降低（P＜0.01），總體呈現(xiàn)出良好的劑量和時間依賴性；根據(jù)GraphPad軟件計算得出IC50值：24 h為（45.05±1.48）μg·mL-1，48 h為（24.47±0.52）μg·mL-1，72 h為（15.90±0.40）μg·mL-1?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果見圖3，給藥劑量越大，克隆形成的數(shù)量越少，密度越小，克班寧的質(zhì)量濃度對肝癌細胞長期增殖能力的影響較大，具有濃度依賴性（P＜0.01）。

圖2 不同濃度克班寧作用不同時間對肝癌Huh7細胞活力的影響（n＝6）Fig 2 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells at different time（n＝6）

圖3 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞活力的影響Fig 3 Effect of different concentrations of crebanine on the viability of Huh7 cells

3.2 克班寧對肝癌Huh7細胞形態(tài)學(xué)的影響

從圖4可觀察到克班寧對Huh7肝癌細胞形態(tài)上的影響較為明顯，對照組肝癌細胞生長狀態(tài)良好，Huh7細胞緊密貼壁，且細胞形狀多保持完整，呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，多為梭形；而隨著克班寧給藥劑量的增加，細胞生長狀態(tài)不斷下降的同時密度也降低，且逐漸出現(xiàn)大量的空泡，當(dāng)給藥劑量達到60 μg·mL-1時，大量肝癌細胞縮小變圓，無法保持基本的癌細胞形態(tài)。這表明克班寧有較好的抑制肝癌Huh7細胞的作用。

圖4 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞形態(tài)的影響Fig 4 Effect of different concentrations of crebanine on the morphology of Huh7 cells

3.3 克班寧對肝癌Huh7細胞的促凋亡作用

從圖5A可以看出，相比于對照組在熒光倒置顯微鏡下呈現(xiàn)出的均勻染色，細胞核形狀完整的狀態(tài)，給予了一定劑量的克班寧的肝癌細胞則逐漸皺縮，破碎，細胞核也大多形態(tài)異常，并且這種狀況隨著劑量的加大而變得更加嚴(yán)重；由流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果可知（見圖5B），克班寧作用于Huh7細胞24 h后，細胞凋亡率隨著濃度的升高而增加，晚期凋亡細胞數(shù)量從對照組的5.13%上升至38.2%，可見克班寧對肝癌Huh7細胞的促凋亡作用有劑量依賴性。

圖5 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of different concentrations of crebanine on the apoptosis of Huh7 cells

3.4 克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達影響

Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果如圖6A所示，與對照組相比，克班寧給藥組肝癌細胞中BAX、Cleaved-PARP 蛋白表達均顯著增加，Bcl-2 蛋白表達則顯著降低；各個凋亡蛋白的相對表達量見圖6B，克班寧的濃度越高，BAX蛋白表達水平越高，相對的Bcl-2 蛋白表達越低。為了研究克班寧對Huh7細胞凋亡和增殖的影響是否與Akt/FoxO3a信號通路有關(guān)，本研究采用Western blot檢測不同濃度克班寧處理的Huh7細胞中相關(guān)蛋白（AKT、p-AKT、FoxO3a和p-FoxO3a）的表達水平。根據(jù)圖7A結(jié)果所示，AKT和FoxO3a的表達水平幾乎保持不變，而p-AKT和p-FoxO3a的表達水平隨著克班寧濃度的增加而下降。綜合圖7B的結(jié)果來看，中、高濃度克班寧顯能著抑制AKT/FoxO3a信號通路蛋白的表達（P＜0.01）。

圖6 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞凋亡蛋白表達的影響Fig 6 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of apoptosis protein in Huh7 cells

圖7 不同濃度克班寧對肝癌Huh7細胞不同蛋白表達的影響Fig 7 Effect of different concentrations of crebanine on the expression of different proteins in Huh7 cells

4 討論

HCC有著起病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，預(yù)后差等特點；且研究發(fā)現(xiàn)HCC患者的平均年生存率低于10%[20]，在晚期肝癌患者全身治療藥物有限，對傳統(tǒng)化療藥物極為不敏感的情況下[21]，即使有類似索拉非尼、樂伐替尼、納武單抗等靶點藥物的出現(xiàn)，也仍有大部分患者因為價格昂貴或者不良反應(yīng)的原因而無法長期使用[22]，而現(xiàn)在，從天然化合物中提取出有效成分，研究其抑制癌癥的功能并開發(fā)成抗腫瘤藥物，已經(jīng)逐漸成為熱點[23-24]。越來越多的證據(jù)表明，天然化合物可以通過抑制HCC的增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等功能來發(fā)揮抗腫瘤作用[25]。

本研究在CCK-8法和克隆形成實驗中觀察到，克班寧在體外顯著抑制肝癌Huh7細胞系的生長，這種抑制能力長期存在；且通過顯微鏡發(fā)現(xiàn)肝癌細胞形態(tài)異常，隨著藥物劑量增大出現(xiàn)空泡化和皺縮，表明其有可能被誘導(dǎo)凋亡，而Hoechst 33258和流式細胞實驗結(jié)果則同時證明了克班寧有促進肝癌凋亡的能力，Western blot檢測到凋亡相關(guān)蛋白BAX和Cleaved-PARP的過表達，Bcl-2的低表達，再次證實了這一猜想。

另外，本實驗還初步探索了克班寧對PI3K/AKT信號通路的影響，過去的研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路在多種人類癌癥中異常激活，如肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等[26]。研究表明激活的PI3K可以磷酸化并激活A(yù)KT，而AKT是PI3K/AKT信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，被激活的AKT調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子促進腫瘤的發(fā)展，其中FoxO3a是AKT的重要靶點之一[27]。在PI3K/AKT信號通路被異常激活后，AKT對FoxO3a的磷酸化觸發(fā)了FoxO3a蛋白，使其從細胞核到細胞質(zhì)的快速重新定位，激活或抑制FoxO3a相關(guān)信號分子；其中，受FoxO3a調(diào)控的Bim、PUMA、14-3-3、FasL和TRAIL都是與凋亡相關(guān)的蛋白[28-29]。而Hagenbuchner等[30]在研究中證明了FoxO3a不僅影響線粒體功能及相關(guān)凋亡因子的表達，還通過誘導(dǎo)線粒體活性氧（ROS）的積累和Bcl-2蛋白家族的表達來控制細胞凋亡的進程。另外，Yan等[31]的研究結(jié)果也表明了庫潘尼西（copanlisib）通過AKT/FoxO3a/PUMA軸對結(jié)直腸癌有細胞毒性和促凋亡作用。還有研究表明，扁蒴藤素（pristimerin）可以直接調(diào)控PI3K/AKT/FoxO3a途徑引發(fā)葡萄膜黑色素瘤的細胞死亡[32]。而在本實驗中發(fā)現(xiàn)克班寧可顯著抑制AKT磷酸化，同時減少FoxO3a的磷酸化，證明克班寧可以干擾AKT/FoxO3a信號的表達，從而對肝癌產(chǎn)生細胞毒性，致使細胞死亡。

綜上所述，克班寧對肝癌Huh7細胞增殖有明顯的抑制作用，同時促進了肝癌細胞的凋亡，能顯著促進或抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達，而早在之前的研究中就已經(jīng)證實AKT/FoxO3a是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵通路之一[33-34]；因此，初步推測克班寧的促凋亡作用可能是通過抑制AKT/FoxO3a信號通路產(chǎn)生的。當(dāng)然，兩者之間的關(guān)系需要進一步的實驗驗證，而本課題組也只是對克班寧抗肝癌作用進行了初步研究，其對肝癌遷移、侵襲和其他功能的影響未來仍需更為深入的探討。