Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化經(jīng)典名方散偏湯的提取工藝

孫萌，劉雪純，趙玥瑛，張晴，席鋮，董爽，張馨雨，杜守穎，白潔，陸洋（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488）

散偏湯為國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的第98方，為治頭痛要方，出自清代陳士鐸所著的《辨證錄》[1]頭痛門卷之二，由川芎、白芍、白芥子、甘草、郁李仁、白芷、香附、柴胡8味藥組成，功效為疏肝解郁、祛風(fēng)止痛，用于治療郁氣不宣，風(fēng)邪襲于少陽經(jīng)之半邊頭風(fēng)。方中川芎為君藥，外散風(fēng)邪，入肝膽經(jīng)，善治頭痛；白芍和甘草合用酸甘化陰、緩急止痛，柴胡和香附合用疏利肝膽、和解少陽，白芷解表散寒、祛風(fēng)止痛，白芥子溫肺化痰、通絡(luò)止痛，以上6味共為臣藥；郁李仁藥性主降，助川芎散之太過，為佐藥；甘草為使藥，可調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代臨床報(bào)道散偏湯可用于治療血管神經(jīng)型偏頭痛、急性缺血性中風(fēng)偏癱、抑郁癥、多囊卵巢綜合征等疾病[2-5]。散偏湯傳統(tǒng)劑型為湯劑，需要臨時(shí)煎煮，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不易保存[6]，將其開發(fā)成顆粒劑能夠克服以上缺點(diǎn)，同時(shí)亦能保證其藥性、藥效，在臨床應(yīng)用上具有重要意義。

根據(jù)經(jīng)典名方顆粒劑開發(fā)研究的相關(guān)文件，顆粒劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）應(yīng)與基準(zhǔn)樣品保持一致，CQAs包括指紋圖譜相似度、指標(biāo)性成分含量以及出膏率。經(jīng)典名方顆粒劑的工藝研究并非以CQAs最高為目的，而是要保證顆粒劑的CQAs與基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍具有較好的一致性，這就給經(jīng)典名方顆粒劑的工藝研究帶來了挑戰(zhàn)。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）采用多元回歸方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，針對目標(biāo)工藝水平進(jìn)行工藝參數(shù)的預(yù)測和優(yōu)化[7-10]，該方法能夠有效解決經(jīng)典名方顆粒劑工藝研究面臨的困難。為保證提取液的CQAs能夠達(dá)到散偏湯基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍，本研究依據(jù)前期確定的基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)[11]選取阿魏酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷和甘草酸含量以及出膏率為綜合評分的指標(biāo)，采取Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JM-B10002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；賽多利斯BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）；DZ47SD20型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；G20型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，自動進(jìn)樣器，LC Solution色譜工作站）[島津（中國）有限公司]；Thermo UItimate3000高效液相色譜儀（DAD檢測器，CM7.2色譜工作站）[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 試藥

阿魏酸（批號：110773-201915，含量：99.0%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號：111702-202006，含量：98.3%）、甘草苷（批號：111610-201908，含量：93.1%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，含量：97.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher公司，色譜純）；乙醇（分析純）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

川芎飲片（批號：2009072，產(chǎn)地四川眉山）、白芍飲片（批號：200623，產(chǎn)地安徽亳州）、白芥子飲片（批號：200213，產(chǎn)地四川南充）、甘草飲片（批號：201804-3，產(chǎn)地甘肅武威）、柴胡飲片（批號：TS-4，產(chǎn)地甘肅康樂）、郁李仁飲片（批號：160944，產(chǎn)地甘肅天水）、白芷飲片（批號：201801-4，產(chǎn)地四川遂寧）、香附飲片（批號：2009080，產(chǎn)地河南開封）（億帆醫(yī)藥股份有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定）。

2 方法與結(jié)果

2.1 散偏湯基準(zhǔn)樣品的制備

取處方量飲片（川芎38 g，白芍19 g，白芥子11 g，甘草4 g，柴胡4 g，郁李仁4 g，白芷2 g，香附8 g）于陶瓷鍋中，加水630 mL，放置浸泡30 min，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮45 min，趁熱用1層300目尼龍布過濾；濾渣加水540 mL，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮35 min，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻，調(diào)整體積至600 mL，即得散偏湯水煎液。精密移取散偏湯水煎液10 mL于30 mL西林瓶中，冰箱-20℃預(yù)冷凍12 h左右，轉(zhuǎn)移至-80℃的真空凍干機(jī)（真空度為＜10 Pa）凍干72 h，取出后壓蓋密塞，即得散偏湯基準(zhǔn)樣品。

2.2 指標(biāo)性成分含量測定方法

2.2.1 色譜條件

① 色譜條件1：色譜柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～10 min，2%乙腈；10～18 min，2%～6%乙腈；18～45 min，6%～10%乙腈；45～90 min，10%～15%乙腈；90～110 min，15%～95%乙腈）；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；波長：321 nm，用于阿魏酸和芥子堿硫氰酸鹽的含量測定。

② 色譜條件2：色譜柱：資生堂CAPCELLPAKC18MGS5（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～8 min，19%～20%乙腈；8～20 min，20%～33%乙腈；20～40 min，33%～50%乙腈；40～45 min，50%～100%乙腈；45～49 min，100%～19%乙腈）；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；波長：237 nm，用于甘草苷和甘草酸的含量測定。

2.2.2 方法學(xué)考察[11]根據(jù)《中國藥典》2020年版方法[12]，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件對含量測定方法進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果見表1，各考察指標(biāo)均符合要求。

表1 散偏湯中指標(biāo)性成分含量測定的方法學(xué)考察Tab 1 Methodological investigation on the content determination of index component in the Sanpian decoction

2.2.3 供試品溶液的制備

① 基準(zhǔn)樣品：取散偏湯基準(zhǔn)樣品2份，于西林瓶中加適量水超聲（250 W，40 kHz）溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，混勻后取5 mL于離心管，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得基準(zhǔn)樣品供試品溶液。

② 提取液：稱取處方量飲片于圓底燒瓶中，加適量水，放置浸泡30 min，回流一段時(shí)間，用1層300目的尼龍布趁熱過濾，冷卻；調(diào)整濾液體積一致，取5 mL于離心管中，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得提取液供試品溶液。

2.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品9.50 mg于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，得到940.50 μg·mL-1的阿魏酸對照品母液，用70%甲醇稀釋成47.03 μg·mL-1的阿魏酸對照品溶液。精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品9.85 mg于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到968.26 μg·mL-1的芥子堿硫氰酸鹽對照品母液，用甲醇稀釋成96.83 μg·mL-1的芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液。

分別精密稱取甘草苷對照品9.69 mg、甘草酸銨對照品10.05 mg于10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，分別得到902.14 μg·mL-1、1002.21 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸對照品母液，用70%乙醇稀釋，分別得到90.21 μg·mL-1、96.20 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸對照品溶液。

2.3 出膏率測定

2.3.1 基準(zhǔn)樣品出膏率的測定 按“2.1”項(xiàng)下方法制備基準(zhǔn)樣品，移取水煎液200 mL至蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上濃縮至稠膏狀，60℃真空干燥72 h，即得散偏湯基準(zhǔn)樣品干膏，按照公式（1）計(jì)算得出膏率；出膏率（%）＝（所得干膏重×水煎液總體積）/（藥味稱樣量×取樣體積）×100% （1）

2.3.2 提取液出膏率的測定 將供試品制備后剩余的藥液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，濃縮至適當(dāng)體積后，置于水浴鍋上濃縮至稠膏狀，60℃真空干燥72 h，按照公式（1）計(jì)算得出膏率。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 加水倍量的考察 稱取處方量飲片于圓底燒瓶中，分別加入散偏湯處方量飲片5倍（450 mL）、10倍（900 mL）、15倍（1350 mL）、20倍（1800 mL）水，放置浸泡30 min，回流提取80 min，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行兩份，測定并取平均值。

結(jié)果見圖1，由圖1可知，4種指標(biāo)性成分的含量及出膏率均隨加水倍量的增加而增加，在5倍量時(shí)最低，20倍量時(shí)最高，15倍到20倍變化不明顯，總體呈現(xiàn)一個(gè)向上的趨勢。高于20倍的加水量對指標(biāo)性成分含量及出膏率提高作用不明顯，為避免資源浪費(fèi)，不再選擇更高的加水倍量，選擇5倍加水量為低水平，20倍加水量為高水平。

圖1 不同加水倍量下各指標(biāo)性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 1 Content of each index component（A）and extract yield（B）at different water times（n＝2）

2.4.2 提取時(shí)間的考察 稱取處方量散偏湯飲片于圓底燒瓶中，加入處方量13倍量（1170 mL）水浸泡30 min，分別回流提取時(shí)60、90、120、150 min，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行兩份，測定并取平均值。

結(jié)果見圖2，由圖2可知，出膏率在60 min時(shí)最低，150 min時(shí)最高，總體呈現(xiàn)一個(gè)向上的趨勢。4個(gè)指標(biāo)性成分含量特別是芥子堿硫氰酸鹽和甘草苷的含量，隨著提取時(shí)間總體上變化不大，除阿魏酸外，其他3種指標(biāo)性成分含量均在90 min時(shí)有最高值，而阿魏酸含量則與提取時(shí)間成正相關(guān)。阿魏酸不穩(wěn)定，濃縮、干燥過程中損失率最大，甘草酸損失率最小，所以雖然甘草酸在150 min含量最低，但為最大程度保證提取液中指標(biāo)性成分的含量，故選擇60 min為低水平，150 min為高水平。

圖2 不同提取時(shí)間下各指標(biāo)性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 2 Contents of each index components（A）and extract yield（B）at different extraction time（n＝2）

2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化散偏湯提取工藝

2.5.1 因素水平設(shè)計(jì) 選取提取時(shí)間A（60 min、105 min、150 min），加水倍量B（5倍、12.5倍、20倍），提取次數(shù)C（1次、2次、3次）三因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以4個(gè)指標(biāo)性成分含量（Y1：阿魏酸含量；Y2：芥子堿硫氰酸鹽含量；Y3：甘草苷含量；Y4：甘草酸含量）和出膏率（Y5）為評價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出最佳提取工藝。

前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在“提取-濃縮-干燥”過程中，4個(gè)指標(biāo)性成分均有一定損失，阿魏酸損失率約為40%，芥子堿硫氰酸鹽損失率約為25%，甘草苷損失率約為20%，甘草酸損失率約為5%。因此，選取各指標(biāo)性成分含量及出膏率作為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合加權(quán)評分，設(shè)置權(quán)重系數(shù)均為0.2，同時(shí)將各成分損失率折算，進(jìn)行綜合評分，綜合評分值越接近0則越接近基準(zhǔn)樣品要求。綜合評分公式如下：

綜合評分＝0.2×（提取液中阿魏酸含量-1.40×基準(zhǔn)樣品中阿魏酸含量）+0.2×（提取液中芥子堿硫氰酸鹽含量-1.25×基準(zhǔn)樣品中芥子堿硫氰酸鹽含量）+0.2×（提取液中甘草苷含量-1.20×基準(zhǔn)樣品中甘草苷含量）+0.2×（提取液中甘草酸含量-1.05×基準(zhǔn)樣品中甘草酸含量）+0.2×（提取液出膏率-基準(zhǔn)樣品出膏率）（2）

根據(jù)Design Expert 10.0軟件進(jìn)行三因素三水平的17次試驗(yàn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)，因素水平表見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3，結(jié)果見表4。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab 2 Factor and level of response surface methodology

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab 3 Box-Behnken design-response surface methodology

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Response surface methodology

2.5.2 模型建立與評價(jià) 根據(jù)17組試驗(yàn)結(jié)果，采用二項(xiàng)式回歸對綜合評分及對應(yīng)的因素（提取時(shí)間、加水倍量、提取次數(shù)）進(jìn)行擬合，得到的回歸方程：綜合評分＝9.19+1.12A+7.99B+11.56C+3.84AB-0.25AC-1.95BC+0.53A2-2.04B2-2.88C2。

對擬合模型進(jìn)行ANOVA方差分析，結(jié)果見表5。該模型的方差P＝0.0001，顯著；模型的失擬項(xiàng)P值為0.0589＞0.05，不顯著，方差顯著而失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且模型與實(shí)際值能較好地?cái)M合。模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9711，調(diào)整決定系數(shù)R2adj＝0.9340，說明該模型能解釋93.40%響應(yīng)值的變化，可信度較好，可以運(yùn)用該模型分析。

表5 方差分析結(jié)果Tab 5 Analysis of variance

該模型中，因素B、C的P值均＜0.0001，表明加水倍量、提取次數(shù)對綜合評分的影響較顯著，3個(gè)因素對綜合評分的影響順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞加水倍量＞提取時(shí)間。此外，根據(jù)等高線圖和3D圖可知，因素A、B、C之間還存在交互作用，具體的響應(yīng)面分析見圖3。3個(gè)交互作用中，圖3C的響應(yīng)面圖坡度最陡，圖3B的次之，圖3A的響應(yīng)面圖坡度最平緩，表明加水倍量與提取次數(shù)的交互作用最強(qiáng)，對綜合評分的影響最大，提取時(shí)間與加水倍量的交互作用較弱，對綜合評分的影響最小。

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig 3 Response surface and contour plot of interactive effect on the comprehensive score

2.5.3 預(yù)測最優(yōu)工藝參數(shù) 采用Design Expert 10.0軟件預(yù)測的提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間60.0 min，加水倍量20.0倍，提取次數(shù)1.1次，此時(shí)的綜合評分預(yù)測值為0.0。根據(jù)實(shí)際情況對提取工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，即加水20倍量（1800 mL）、提取60 min、提取1次。

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照調(diào)整后的預(yù)測工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(x±s，n＝3)Tab 6 Verification test of response surface (x±s，n＝3)

3 討論

經(jīng)典名方是歷代醫(yī)家臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，對經(jīng)典名方的研究和開發(fā)既能實(shí)現(xiàn)中藥劑型現(xiàn)代化創(chuàng)新，也能夠推動中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。經(jīng)典名方作為體現(xiàn)中藥復(fù)方配伍理論的重要載體，往往是由多種成分共同作用而起效的，不同的制備工藝參數(shù)往往會導(dǎo)致其成分組成和相對含量的變化，因此制備工藝研究是經(jīng)典名方開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本研究以單因素試驗(yàn)確定了加水倍量和提取時(shí)間的上下限，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)，以提取液中4個(gè)指標(biāo)性成分含量及出膏率為指標(biāo)，通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)及綜合加權(quán)評分對不同提取條件的結(jié)果進(jìn)行直觀分析，優(yōu)選散偏湯提取工藝，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證了優(yōu)選工藝的可行性。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同提取條件下的水煎液的指紋圖譜相似度與基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)比均大于0.9，相似度良好，說明不同提取條件下指紋圖譜相似度差異不大，故雖然指紋圖譜相似度屬于CQAs，但在考察提取工藝時(shí)未將指紋圖譜相似度納入評分標(biāo)準(zhǔn)。

本研究在散偏湯飲片回流提取之前采取先將飲片浸泡30 min的方法，其原因在于前期研究發(fā)現(xiàn)浸泡后4個(gè)指標(biāo)性成分含量相較于不浸泡組均有升高，且前期基準(zhǔn)樣品的制備也采用了飲片浸泡30 min的方法，基準(zhǔn)樣品是制劑工藝篩選及制劑標(biāo)準(zhǔn)制訂的依據(jù)和準(zhǔn)繩[13]，為了保持一致性，故在提取工藝的考察部分試驗(yàn)仍繼續(xù)采用飲片浸泡30 min的方法。

前期考察發(fā)現(xiàn)在提取-濃縮-干燥過程中，阿魏酸的損失率高達(dá)40%，其原因?yàn)榘⑽核嵋匀芤籂顟B(tài)存在時(shí)不穩(wěn)定，易受外界和溶液環(huán)境等因素的影響，在高溫及光照情況下易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[14-15]，因此在考察提取時(shí)間時(shí)充分考慮了阿魏酸損失率高的實(shí)際情況，選取阿魏酸含量較高的150 min為高水平。

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，15批基準(zhǔn)樣品中，4個(gè)指標(biāo)性成分含量已確定的范圍為：每個(gè)處方含阿魏酸19.08～35.43 mg，芥子堿硫氰酸鹽38.02～70.60 mg，甘草苷14.65～27.21 mg，甘草酸21.17～39.31 mg。試驗(yàn)最終優(yōu)選散偏湯提取工藝為加水20倍（1800 mL），浸泡30 min，提取60 min，提取1次，根據(jù)3組驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，得到每個(gè)處方中阿魏酸含量均值為40.54 mg、芥子堿硫氰酸鹽含量均值為70.87 mg、甘草苷含量均值為22.30 mg、甘草酸含量均值為40.63 mg，出膏率均值為23.83%，綜合評分為-3.9655，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果減去“提取-濃縮-干燥”過程的損失，均滿足前期建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且與響應(yīng)面法預(yù)測值接近，表明該提取工藝可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。