血清miRNA水平與急性缺血性腦卒中患者病情程度和炎癥反應的相關性研究

張明穎 張小燕 肖井楠 王守章

近年來，隨著人口老齡化的加劇和人們生活方式的改變，腦卒中發(fā)病率不斷上升。腦卒中具有高致死率和高致殘率，因此在腦卒中的早期對病情作出評估臨床意義重大。急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是腦卒中的重要類型，既往研究發(fā)現(xiàn)，免疫異常激活引發(fā)的炎癥因子水平變化在AIS 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA，可通過與靶基因非編碼區(qū)（3'UTR）結合調控靶基因表達，不僅參與細胞分化、凋亡等細胞周期活動，對機體氧化應激和炎癥反應也有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-126、miR-221 可能與神經細胞缺血再灌注損傷相關，miR-30a、miR-409 可能與神經細胞自噬相關[4-7]。這些功能均與AIS 發(fā)生、發(fā)展相關，因此探討此類miRNA 與AIS 的關系，可能對AIS 早期病情評估和治療方案選擇具有重要指示意義?；诖?，本研究檢測了AIS 患者血清miRNA 水平，分析其表達與AIS 病情程度和炎癥反應的關系，以期為AIS患者的早期病情評估和臨床治療干預提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象及分組 選擇2020年2月至2022年1月浙江新安國際醫(yī)院收治的90 例AIS 患者作為觀察組。納入標準：（1）符合中國急性缺血性腦卒中診治指南對AIS 的定義[8]，并經頭顱MRI 檢查確診為AIS。（2）臨床資料完整。排除標準：（1）合并顱內感染、出血或顱內腫瘤等；（2）伴嚴重心、肝、腎重要臟器或血液系統(tǒng)疾??；（3）有精神疾病史或其他原因導致的神經功能缺損；（4）不耐受MRI 或有MRI 檢查禁忌證。選取同期本院健康體檢正常者110 名作為對照組。比較兩組對象性別、年齡、BMI、高血壓史、糖尿病史、卒中史、高脂血癥、吸煙史和飲酒史等一般基線資料，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會審核批準，且所有納入對象均知情同意。觀察組按照梗死體積分為小梗死體積組（≤3 cm3，37 例）和大梗死體積組（＞3 cm3，53 例），按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（national institute of health stroke scale，NIHSS）評分[9]分為輕度組（NIHSS 評分＜7 分，25 例）和中重度組（NIHSS 評分≥7 分，65 例）。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司，批號：20211112；人CRP ELISA 試劑盒、人TNF-α ELISA 試劑盒、人IL-12 ELISA 試劑盒和人IL-35 ELISA 試劑盒均購自上海科艾博生物科技有限公司，批號分別為20211011、20210108、202100922 和20210817。

1.3 方法 取受試者空腹靜脈血約10 ml，離心吸取上層血清分裝于A、B 兩個試管。取A 管血清，根據試劑盒方法提取總RNA 并進行逆轉錄，采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-30、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409 相對表達水平。引物由新貝（上海）生物科技有限公司提供，引物序列見表1。以U6 RNA為內參基因。根據2-ΔΔCt計算5 種miRNA 的相對表達水平。取B 試管血清，采用ELISA 法，分別測定血清中CRP、TNF-α、IL-12 和IL-35 表達水平。嚴格按照說明書操作執(zhí)行。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關進行相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象血清miRNA、炎癥因子水平比較 與對照組相比，觀察組血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平顯著升高，miR-409 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組對象血清miRNA、炎癥因子水平比較

2.2 不同梗死體積AIS 患者血清miRNA 和炎癥因子水平比較 與小體積梗死組相比，大體積梗死組患者血 清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平顯著升高，miR-409 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 不同梗死體積AIS 患者血清miRNA 和炎癥因子水平比較

2.3 不同NIHSS 評分AIS 患者血清miRNA 和炎癥因子水平比較 與輕度卒中組相比，中重度卒中組患者血 清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平更高（均P＜0.05），miR-409水平更低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 不同NIHSS 評分AIS 患者血清miRNA 和炎癥因子水平比較

2.4 AIS 患者血清miRNA 水平與梗死體積、NIHSS 評分及炎癥因子水平的相關性分析 Pearson 相關分析表明，患者血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221水平與梗死體積、NIHSS 評分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈正相關（均P＜0.05）；而miR-409 與梗死體積、NIHSS 評分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 均呈負相關（均P＜0.05），見表5。

表5 AIS 患者血清miRNA 水平與病情嚴重程度和炎癥反應的相關性（r）

3 討論

目前，臨床診斷AIS主要是依靠CT、MRI等技術，準確性較高[10-12]。但AIS多發(fā)病突然，患者在出現(xiàn)明顯癥狀前，鮮少主動進行相關檢查。血清學指標檢測具有采集方便、檢測準確等特點，在諸多醫(yī)學檢測手段中應用廣泛。如果能尋找到與AIS 發(fā)生、發(fā)展密切相關的血清學指標，將對AIS 的提前確診和發(fā)展評估具有重要意義。

miRNA 是當前熱門的血清學指標。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA 與AIS 發(fā)生、發(fā)展相關[13-16]。AIS 相關miRNA主要分為兩類，一類與神經細胞凋亡、自噬以及腦細胞缺血、氧化和腦神經保護相關；另一類與神經缺血再灌注損傷相關。一項針對腦卒中小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，腦卒中小鼠血清miR-30a 明顯升高[17]。提示miR-30a 與神經細胞凋亡有關。羅斌等[18]在小鼠腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，miR-122 可能通過抑制胰島素樣生長因子受體表達對腦部造成損傷。miR-126 被認為通過抑制血管黏附因子干擾血管內皮生長因子信號通路傳導[19-23]。張偉等[24]發(fā)現(xiàn)，血清miR-221 對腦部損傷主要與腦部缺血再灌注損傷相關，其可能通過靶向激活炎癥反應與急性腦梗死的發(fā)生及神經損傷的加重有關。本研究結果顯示，miR-30a、miR-122、miR-126 和miR-221 水 平 在AIS 患者血清中明顯升高；梗死體積更大的AIS 患者，病情也更嚴重。

miR-409 通過促進胰島素樣生長因子受體表達，起到保護腦部的作用。俞嶺芳等[25]研究發(fā)現(xiàn)，AIS 患者外周血miR-409 水平下降，與本研究結果相似，提示血清miR-409 水平下降越明顯的患者病情越嚴重。

炎癥反應是AIS 患者機體的臨床反應之一。本研究結果顯示，AIS 患者CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平明顯高于正常人群，隨著梗死體積和NIHSS 評分升高，炎癥因子水平越高，即提示患者病情越嚴重，炎癥反應越劇烈?？赡茉驗锳IS 是一種累及頸動脈、冠狀動脈以及主動脈和橈動脈等全身性疾病，患者發(fā)病后，缺血中心區(qū)能量耗竭，附近區(qū)域神經細胞發(fā)生不可逆損傷。同時，缺血半暗帶存在殘余灌注，激活復雜的炎性級聯(lián)反應，釋放大量的炎癥介質，最終破壞神經細胞，加重了機體的病變。

本研究相關性分析結果顯示，AIS患者血清miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221水平與梗死體積、NIHSS評分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈正相關；miR-409 與梗死體積、NIHSS 評分及CRP、TNF-α、IL-12、IL-35 水平均呈負相關。提示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221 和miR-409 可能通過影響機體的炎癥水平，對AIS發(fā)生、發(fā)展產生影響。

由于本研究納入樣本數(shù)量有限，又是單中心研究，研究結果可能存在一定局限性。miRNA 是否能夠作為AIS 患者新的生物標志物檢測指標仍需要大規(guī)模多中心研究予以驗證確定。同時，由于miRNA 調控AIS 發(fā)生和發(fā)展的機制尚不完全清楚，仍需通過大量基礎試驗進一步探索。

綜上所述，miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221和miR-409 水平與AIS 患者病情嚴重程度和炎癥反應相關。檢測AIS 患者血清中miRNA 水平對預防AIS 發(fā)生、評估病情、延緩疾病進展具有一定的積極意義。