生物鐘節(jié)律和膿毒癥交互作用關(guān)系的研究進展

常寧 裴穎皓

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失控導(dǎo)致的威脅生命的多器官功能不全綜合征。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有新發(fā)膿毒癥病例4 890 萬例，其中死亡約1 100 萬例，占全球總死亡人數(shù)的19.7%[1]。生物鐘振蕩調(diào)節(jié)機制普遍存在于生物體內(nèi)，全面且深入影響生理生化代謝、睡眠周期以及行為活動等[2]。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥可導(dǎo)致生物鐘節(jié)律紊亂，而紊亂的生物鐘節(jié)律又可以進一步造成細胞周期代謝紊亂、細胞凋亡和機體免疫功能異常等。本文就生物鐘節(jié)律與膿毒癥免疫炎癥關(guān)系的相關(guān)研究進展作一綜述，以期揭示膿毒癥對于生物鐘節(jié)律的干擾影響機制，了解生物鐘節(jié)律的完整穩(wěn)定對于保護機體免于膿毒癥反應(yīng)失控的重要性，并從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度進一步認識傳統(tǒng)中醫(yī)關(guān)于“天人相應(yīng)”“五運六氣”“陰陽交替”“子午流注”等關(guān)于時間周期節(jié)律理論的科學(xué)性和合理性，為尋找更為有效的臨床治療方法提供啟發(fā)，最終改善患者轉(zhuǎn)歸預(yù)后。

1 膿毒癥與生物鐘紊亂的交互關(guān)系

1.1 生物鐘節(jié)律紊亂影響膿毒癥的病理生理學(xué)研究 人體的生理代謝和行為活動等都存在一定的時間節(jié)律，是幾乎所有生理功能和器官系統(tǒng)穩(wěn)定運作的基礎(chǔ)，這種節(jié)律性的改變受生物鐘基因所調(diào)控。哺乳動物體內(nèi)的生物鐘主要分為中樞生物鐘和外周生物鐘兩類，前者位于下丘腦視交叉上核，后者幾乎存在于所有組織器官內(nèi)。生理情況下，兩類生物鐘相互調(diào)控和影響，負責(zé)機體晝夜節(jié)律、睡眠-覺醒周期、體溫、血壓等[3]。膿毒癥狀態(tài)下動物體內(nèi)生物鐘系統(tǒng)可能紊亂。動物實驗發(fā)現(xiàn)，白天腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）造模的膿毒癥小鼠總體死亡率要明顯高于夜間造模的膿毒癥小鼠[4]。將造模試劑從LPS 改為TNF 腹腔注射，或通過外科手術(shù)盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）構(gòu)建膿毒癥模型，依然可見白天造模的膿毒癥小鼠死亡率明顯高于夜間造模的小鼠[5]。使用CLP 造模的大鼠，腦電圖顯示睡眠是碎片化的，快速眼動睡眠被抑制，睡眠-覺醒周期受到干擾[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在6：00～12：00 收治的腦膜炎球菌感染導(dǎo)致膿毒癥的患兒，其死亡率、截肢率和植皮需求均高于當天其余時間入院的患兒，說明病情嚴重程度與晝夜節(jié)律變化相關(guān)[7]?？梢娚镧娬{(diào)控生物節(jié)律影響膿毒癥狀態(tài)下的病理生理學(xué)改變。

1.2 膿毒癥影響生物鐘節(jié)律的研究 膿毒癥狀態(tài)也會影響生物鐘節(jié)律。生物鐘節(jié)律性振蕩受多個生物鐘基因組成的轉(zhuǎn)錄負反饋環(huán)的調(diào)控，這些基因在一個復(fù)雜的反饋回路網(wǎng)絡(luò)中相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)有節(jié)奏地表達，幫助調(diào)節(jié)各種生理過程的時間。該負反饋環(huán)由正性組件Clock 蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）及腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白的類似蛋白1（brain and muscle-arnt-like1，Bmal1）、負性組件晝夜節(jié)律蛋白（period circadian protein，Per）1～3 和隱花色素蛋白（crypto chrome，Cry）1～2組成[8]。Clock 基因位于4號染色體長臂，存在于下丘腦前部的視交叉上核。Clock 與Bmal1 形成異二聚體復(fù)合物可與靶基因啟動子中的特定DNA 序列即增強框（enhancer box，E-box）結(jié)合，進一步激活Per 和Cry 轉(zhuǎn)錄表達，而后兩者蛋白的積累可負反饋抑制Clock-Bmal1 與E-box 的結(jié)合。這種轉(zhuǎn)錄-翻譯負反饋閉環(huán)有助于調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，是機體生物鐘的核心調(diào)控機制[9]。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥狀態(tài)下小鼠體內(nèi)上述生物鐘基因水平顯著降低，而敲除Per 2 基因可明顯降低膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥風(fēng)暴程度，提高小鼠體內(nèi)皮質(zhì)醇水平，降低總體死亡率[10]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，敲除Clock 基因可明顯提高膿毒癥小鼠的存活率[11]。這兩項研究結(jié)果均提示，膿毒癥狀態(tài)下生物鐘基因波動幅度和節(jié)律均出現(xiàn)抑制，無論敲除生物鐘正性組件還是負性組件，都可以消除白天和夜間時間點造模對于膿毒癥死亡的影響。

可見生物鐘與膿毒癥關(guān)系密切，生物鐘調(diào)控生物節(jié)律影響著膿毒癥狀態(tài)下的病理生理學(xué)改變，而膿毒癥狀態(tài)則會造成生物鐘的節(jié)律波動幅度減弱。

2 膿毒癥狀態(tài)下生物鐘紊亂的機制

2.1 免疫炎癥介導(dǎo)的生物鐘紊亂 膿毒癥與生物鐘之間的相關(guān)分子機制尚未完全明確，目前認為膿毒癥狀態(tài)下免疫炎癥風(fēng)暴和生物鐘紊亂關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型中，白天造模的大鼠體內(nèi)TNF-α 等炎癥因子水平上升速度和幅度明顯高于夜間造模的大鼠，因此死亡率也明顯升高[12]，而敲除TNF-α 受體和Toll 樣受體2 可消除晝夜造模的小鼠死亡差異[13-14]。巨噬細胞的激活與分化是膿毒癥炎癥損傷中的重要環(huán)節(jié)，對于LPS 腹腔注射或經(jīng)CLP 手術(shù)造模的膿毒癥動物模型來說，腹腔液中的巨噬細胞是最先激動的炎癥細胞。研究發(fā)現(xiàn)，白天腹腔注射LPS 構(gòu)建膿毒癥模型，大鼠腹腔灌洗液中巨噬細胞大多分化為M1 型，該類型巨噬細胞以促炎反應(yīng)為主，誘導(dǎo)細胞凋亡和加重局部血栓形成；而夜間造模大鼠的腹腔灌洗液中上述改變明顯較輕[12，15-16]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥肝損傷小鼠模型中，敲除Bmal1 基因可造成肝臟組織M1 型巨噬細胞表達增多，肝臟炎癥損傷加重[17]。上述結(jié)果說明生物鐘調(diào)控的生物節(jié)律影響了膿毒癥狀態(tài)下免疫炎癥反應(yīng)的程度。

膿毒癥狀態(tài)下，宿主對感染反應(yīng)失控出現(xiàn)免疫炎癥狀態(tài)也會造成生物鐘的紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，無論是LPS 藥物造模還是CLP 手術(shù)造模，膿毒癥動物模型中都可以觀察到巨噬細胞Bmal1 基因節(jié)律性振蕩減弱[18-19]。Bmal1 在膿毒癥模型動物炎癥反應(yīng)中的角色存在爭論，有研究發(fā)現(xiàn)敲除Bmal1 可導(dǎo)致膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)加重，死亡率明顯升高[20]。但也有研究發(fā)現(xiàn)敲除Bmal1 后小鼠的抗炎能力升高[21]。這之間的矛盾可能和膿毒癥感染機體免疫狀態(tài)有關(guān)。宿主在感染狀態(tài)下免疫反應(yīng)機制極為復(fù)雜，可以概括為兩個階段，早期是劇烈的炎癥損傷反應(yīng)，屬于免疫亢進狀態(tài)；后期則屬于免疫抑制狀態(tài)。這種膿毒癥不同階段免疫狀態(tài)的差異可以解釋Bmal1 的抗炎和促炎屬性。

上述結(jié)果說明，生物鐘影響著膿毒癥狀態(tài)下的免疫炎癥反應(yīng)，而膿毒癥狀態(tài)下宿主對于感染產(chǎn)生的失控的免疫炎癥反應(yīng)也會影響生物鐘的節(jié)律。

2.2 內(nèi)環(huán)境改變導(dǎo)致的生物鐘紊亂 生理狀態(tài)下，機體體溫存在晝夜波動，波動幅度約為0.5～1.0 ℃，通常清晨體溫最低，下午體溫最高，這種波動受生物鐘基因調(diào)控。膿毒癥狀態(tài)下，患者可出現(xiàn)高熱或低體溫等體溫異常，而低體溫也預(yù)示著不良臨床預(yù)后[22]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 藥物造模和CLP 手術(shù)造模的膿毒癥動物模型，都可以觀察到白天造模的小鼠出現(xiàn)低體溫程度更為嚴重[12，23]。機體的體溫控制中樞位于下丘腦的視前區(qū)，視交叉上核和室旁核。研究發(fā)現(xiàn)LPS 注射后小鼠上述體溫中樞電活動增加[24-25]，白天造模小鼠上述體溫中樞異常電活動更為劇烈[10]。環(huán)境溫度的晝夜波動通過外周溫度感受器反饋至大腦體溫中樞，進而影響體溫中樞的生物鐘節(jié)律；而中樞生物鐘節(jié)律又進一步調(diào)控機體核心溫度以適應(yīng)環(huán)境溫度。膿毒癥可打亂這種雙向調(diào)節(jié)的反饋機制，引起體溫調(diào)節(jié)異常。

糖代謝紊亂是膿毒癥狀態(tài)下常見的代謝改變。由于機體能量代謝異常，糖酵解增加，肝糖原異生代償能力有限等原因，膿毒癥患者易出現(xiàn)低血糖情況，這也是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的重要危險因素[26-27]。低血糖的發(fā)生與飲食熱卡攝入關(guān)系密切，而進食的本身也是影響生物鐘節(jié)律的因素之一。嚴格控制預(yù)處理飲食時間可消除進食對小鼠生物鐘的影響，白天LPS造模膿毒癥小鼠出現(xiàn)低血糖的發(fā)生率與死亡率成正相關(guān)，均明顯高于夜間造模小鼠[15]；此外在白天造模的小鼠體內(nèi)還可以觀察到核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（Nod-like receptor protein-3，NLRP3）炎癥小體的表達水平和活化程度明顯上升[28]。NLRP3 炎癥小體主要位于細胞漿，由氨基末端的吡啶結(jié)構(gòu)域、中央結(jié)構(gòu)域和羧基末端富亮氨酸重復(fù)序列組成[29]。而Clock基因正好參與調(diào)控NLRP3 炎性體的表達和活化[30]。膿毒癥狀態(tài)下，NLRP3 炎癥小體受病原體相關(guān)分子模式等啟動信號的刺激而處于高反應(yīng)性狀態(tài)，經(jīng)第二激活信號刺激后，細胞凋亡蛋白酶激活，IL-1β 和IL-18 等促炎因子表達水平升高，通過影響胰島素功能參與糖代謝[31]。因此，膿毒癥狀態(tài)下，NLRP3 炎癥小體被認為是生物鐘基因影響血糖代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點，但具體分子機制還需進一步探明。

膿毒癥狀態(tài)下的凝血和纖溶系統(tǒng)功能障礙表現(xiàn)為全身凝血系統(tǒng)活化、抗凝因子大量消耗、纖溶系統(tǒng)功能紊亂等，這些被稱為膿毒癥相關(guān)凝血病。據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥相關(guān)凝血病的發(fā)生率約為50%～70%，其中35%發(fā)展為彌散性血管內(nèi)凝血[32]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1 基因敲除可造成小鼠纖溶酶原激活物抑制劑-1 表達升高，伴隨高凝狀態(tài)，誘發(fā)動靜脈血栓的形成[33]。同時，沉默Bmal1 基因可進一步加重膿毒癥小鼠凝血因子異常，表現(xiàn)為凝血因子Ⅶ表達下降和凝血因子Ⅻ表達上升[34]。組織因子途徑是膿毒癥相關(guān)凝血病的關(guān)鍵病理機制。在膿毒癥狀態(tài)下，機體過度的免疫炎癥反應(yīng)造成組織器官損傷，大量組織因子釋放入血激活外源性凝血途徑，誘發(fā)高凝狀態(tài)[35]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織中組織因子基因轉(zhuǎn)錄和翻譯存在日節(jié)律性，表現(xiàn)為白天合成活躍，夜間合成減少，敲除生物鐘Clock 基因后這種組織因子的日節(jié)律性消失[36]。由此可見，生物鐘調(diào)控著凝血和纖溶系統(tǒng)，生物鐘節(jié)律紊亂與膿毒癥相關(guān)凝血病密切相關(guān)。

3 小結(jié)

綜上所述，生物鐘節(jié)律紊亂與膿毒癥狀態(tài)下體溫調(diào)節(jié)異常、能量代謝障礙以及凝血功能失調(diào)等內(nèi)環(huán)境紊亂密切相關(guān)，見圖1。生物鐘節(jié)律與膿毒癥互有聯(lián)系，相互作用。生物鐘調(diào)控生物內(nèi)在節(jié)律影響著膿毒癥狀態(tài)下的免疫炎癥反應(yīng)，干預(yù)膿毒癥狀態(tài)下的病理生理學(xué)改變，可能對于機體恢復(fù)平衡穩(wěn)定狀態(tài)有益。而膿毒癥狀態(tài)下宿主對于感染產(chǎn)生的失控的免疫炎癥反應(yīng)也會影響生物鐘的自身節(jié)律，造成生物鐘的節(jié)律波動幅度減弱。深入研究膿毒癥狀態(tài)下生物鐘分子病理機制有助于進一步了解膿毒癥的病理機制，尋找到更為有效的臨床治療方法和途徑，改善膿毒癥臨床預(yù)后。

圖1 膿毒癥與生物節(jié)律異常