替格瑞洛對(duì)急性心肌梗死患者TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響研究

姜曉黎 胡昊彧 黃瑋

急性心肌梗死主要指冠狀動(dòng)脈持續(xù)性、急性缺血缺氧所致的心肌壞死，病死率高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1-2]。急性心肌梗死若治療不當(dāng)可發(fā)生心源性休克、心力衰竭，甚至可能造成患者死亡[3-4]。因此，及時(shí)有效治療急性心肌梗死尤為重要。替格瑞洛是可逆性血小板P2Y12 受體拮抗劑，治療心血管疾病有良好療效[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死進(jìn)展與慢性炎癥存在一定相關(guān)性，而Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 炎癥信號(hào)通路系統(tǒng)參與心肌炎癥反應(yīng)，并且與急性心肌梗死發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密[6]?；诖?，本研究探討替格瑞洛對(duì)急性心肌梗死患者TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的影響及其可能作用機(jī)制，以期為臨床治療急性心肌梗死提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院2021年1月至2022年6月收治的142 例急性心肌梗死患者，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組與對(duì)照組各71例。觀察組男45 例，女26 例；年齡41～75（59.79±8.84）歲；發(fā)病至入院時(shí)間3～34（18.81±4.35）h；病變血管數(shù)1～3（1.62±0.37）支；心功能分級(jí)：Ⅰ級(jí)21 例，Ⅱ級(jí)41 例，Ⅲ級(jí)9 例。對(duì)照組男47 例，女24 例；年齡40～73（58.98±9.19）歲；發(fā)病至入院時(shí)間3～35（19.35±5.16）h；病變血管數(shù)1～3（1.65±0.41）支；心功能分級(jí)：Ⅰ級(jí)23 例，Ⅱ級(jí)38 例，Ⅲ級(jí)10 例。兩組患者一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）診斷符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]標(biāo)準(zhǔn)；（2）首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間＜36 h；（3）胸痛時(shí)間＞30 min；（4）簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急、慢性感染者；（2）合并自身免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾??；（3）合并心源性休克、心力衰竭及嚴(yán)重肝腎功能不全；（4）過(guò)敏體質(zhì)者；（5）惡性腫瘤者；（6）嚴(yán)重精神疾病者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 對(duì)照組予以阿司匹林腸溶片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20160685；拜耳醫(yī)藥保健有限公司）口服，100 mg/次，1 次/d；瑞舒伐他汀鈣片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20080670；南京正大天晴制藥有限公司）口服，10 mg/次，1 次/d。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用替格瑞洛片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H20193166；石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司）口服，90 mg/次，2 次/d。兩組患者療程均為4 周。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)《急性心肌梗死診斷和治療指南》標(biāo)準(zhǔn)[7]，患者心電圖基本恢復(fù)正常、癥狀消失為顯效，患者ST 段下降者恢復(fù)0.1 mV 以上、但未達(dá)到正常，癥狀有所好轉(zhuǎn)為有效，未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)效。總有效率=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心功能測(cè)定 采用彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司，HD5G 型）測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVDD）。

1.4.2 血小板聚集率測(cè)定 采用血小板儀（北京柏彬醫(yī)療器械有限公司，AggRAM）測(cè)定患者血小板聚集率。

1.4.3 TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達(dá)的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法。采集患者治療前與治療4 周末外周靜脈血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）；依據(jù)Trizol 試劑盒（昆山遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：15596-026）說(shuō)明書(shū)提取總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（昆山遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：15781-013）方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（昆山遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：16027-018）方法配置反應(yīng)體系，其中SYBER GREEN 6.8 μl，上下游引物各0.4 μl，DYE I 0.4 μl，cDNA模板2.0 μl，RNase-free H2O 10 μl。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃35 s，40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4.4 TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western blot 法。取患者治療前與治療4周末外周靜脈血，提取PBMC，提取細(xì)胞總蛋白，電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉2 h后，加入一抗TLR4（美國(guó)Abacm公司，批號(hào)：ab150583）、MyD88（美國(guó)Abacm 公司，批號(hào)：ab2064）、NF-κB（美國(guó)Abacm 公司，批號(hào)：ab538）處理，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影后記錄蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者療效比較 觀察組總有效率高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者療效比較[例（%）]

2.2 兩組患者心功能比較 相比治療前，治療后兩組患者LVEF 均顯著升高，LVPWT 和LVDD 均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比對(duì)照組，觀察組患者治療后LVEF 顯著升高，LVPWT 和LVDD 顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 兩組患者心功能比較

2.3 兩組患者血小板聚集率比較 相比治療前，治療后兩組患者血小板聚集率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比對(duì)照組，觀察組患者治療后血小板聚集率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 兩組心肌梗死患者血小板聚集率比較

2.4 兩組TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達(dá)的比較 相比治療前，治療后兩組患者TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比對(duì)照組，觀察組患者治療后TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組患者TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 兩組患者TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)的比較 相比治療前，治療后兩組患者TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)灰度值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比對(duì)照組，觀察組患者治療后TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)灰度值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 兩組患者TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)灰度值比較

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，急性心肌梗死患病率呈不斷上升趨勢(shì)，且具有較高病死率，及時(shí)有效地治療尤為關(guān)鍵[9-10]。目前，急性心肌梗死主要采用抗血小板聚集、溶栓、介入手術(shù)等治療[11-12]。

血小板P2Y12 受體能夠與G 蛋白偶聯(lián)，通過(guò)與ADP 高親和力結(jié)合誘導(dǎo)血小板GP Ⅱb/Ⅲa 受體活化與顆粒釋放，以此可穩(wěn)定血小板聚集，促進(jìn)血栓烷的形成[13-14]。替格瑞洛是新型可逆性拮抗血小板P2Y12 受體的一種環(huán)戊基三唑嘧啶類(lèi)藥物，無(wú)需經(jīng)肝臟代謝，為活性前體，口服后能夠直接抑制P2Y12 受體，起效快，并且療效穩(wěn)定[15-17]。研究發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛與受體結(jié)合后可阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制血小板活性；由于與血小板活性代謝產(chǎn)物類(lèi)似，替格瑞洛被用來(lái)拮抗血小板聚集[18]。黃玲芳等[19]對(duì)138 例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的急性心肌梗死患者的研究顯示，替格瑞洛聯(lián)合匹伐他汀治療總有效率為94.20%，治療后患者LVEF 升高，LVEDV 和LVESV 降低，可見(jiàn)替格瑞洛聯(lián)合匹伐他汀治療可提高療效及改善心功能。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，觀察組總有效率升高，治療后患者LVEF 升高，LVPWT 和LVDD 降低，可見(jiàn)替格瑞洛可提高療效及改善患者心功能。血小板聚集率可反映機(jī)體血小板聚集效率。血小板在血管內(nèi)皮黏附和聚集，在多種炎癥因子和信號(hào)通路刺激，血小板聚集并形成血栓，導(dǎo)致血管阻塞加劇，心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)升高[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患者治療后血小板聚集率低于對(duì)照組，可見(jiàn)替格瑞洛可降低患者血小板聚集率。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死與慢性炎癥密切相關(guān)[22]。心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心肌長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧和ATP 供應(yīng)不足，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和壞死，由此激活自身免疫系統(tǒng)啟動(dòng)，造成劇烈的炎癥反應(yīng)。TLRs 和NF-κB信號(hào)通路經(jīng)多種生物學(xué)參與疾病進(jìn)程，并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLR 在心肌梗死后被激活，介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥損傷，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放。此后，活化的TLR 通路激活MyD88 依賴(lài)性信號(hào)通路，以此促進(jìn)機(jī)體過(guò)度釋放促炎因子。TLR4 是TLR 家族中重要的炎癥反應(yīng)受體，在多種疾病炎癥疾病中發(fā)揮作用。TLR4過(guò)度表達(dá)能夠通過(guò)MyD88 途徑激活下游NF-κB，促進(jìn)LOX-1 等炎癥因子表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成心血管事件[23]。NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的成員之一，能夠調(diào)控多種炎癥介質(zhì)、受體及生長(zhǎng)因子的表達(dá)，部分因子和蛋白又可活化NF-κB，從而形成正反饋效應(yīng)，即NF-κB 的持續(xù)活化加重了炎癥反應(yīng)。本研究表明，觀察組治療后TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)灰度值均低于對(duì)照組，可見(jiàn)替格瑞洛可能通過(guò)下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)，減輕局部炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)患者心功能，以此提高臨床療效，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確，還需后續(xù)增加樣本量，做多中心、多樣本深入研究，提供可靠的臨床參考價(jià)值。

綜上所述，替格瑞洛對(duì)急性心肌梗死患者臨床療效顯著，其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。