維生素D3對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠氧化應(yīng)激的保護(hù)作用研究

余躍 楊濤濤 俞璐

自身免疫性甲狀腺炎又稱(chēng)橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT），是一種器官特異性自身免疫性疾病，是最常見(jiàn)的甲狀腺疾病之一。目前尚無(wú)有效措施能延緩這種甲狀腺炎癥的發(fā)展[1-2]。HT 的發(fā)病機(jī)制主要涉及細(xì)胞和體液免疫，但導(dǎo)致甲狀腺組織破壞的病理機(jī)制仍未闡明[3-4]。近年來(lái)研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的甲狀腺組織損傷、細(xì)胞凋亡等在HT 發(fā)病過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）模型大鼠體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激紊亂[7]。因此，使用適宜抗氧化制劑可能是HT 治療的一個(gè)新思路。諸多研究證實(shí)，維生素D 除了具有調(diào)節(jié)鈣磷及骨代謝等作用外，還具有抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種醫(yī)療價(jià)值[8-9]，如通過(guò)減少活性氧、增加抗氧化能力來(lái)減輕糖尿病腎病、酒精性肝損傷、腦缺血再灌注損傷等疾病中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮組織保護(hù)作用[10-12]。目前關(guān)于HT 患者體內(nèi)缺乏維生素D 的報(bào)道逐漸增多，提示維生素D 可能參與了HT 的發(fā)生、發(fā)展，補(bǔ)充維生素D 或有助于HT 相關(guān)癥狀的緩解[13-15]，但是維生素D 治療和改善HT 的作用機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。本研究構(gòu)建EAT 大鼠模型并予維生素D3藥物干預(yù)，觀察甲狀腺組織煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶亞基p22phox、gp91phoxmRNA 和蛋白表達(dá)的變化，血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平的變化，來(lái)探究維生素D3對(duì)HT 患者氧化應(yīng)激的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（200±10）g，雌雄各半，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SYXK[浙]2019-0005）進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查。

1.1.2 主要試劑 維生素D3粉劑（純度98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)：C12700602；豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin，PTg）購(gòu)自北京酷爾化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20211223；不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）和完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)分別為SLCB8702、SLBW7430；甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和甲狀腺球蛋白抗體（thyroid globulin antibody，TgAb）ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)分別為EHTPO、EHTG；SOD、GSH-Px 和MDA 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司，批號(hào)分別為20220507、20220506、20211214；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：10494-1-AP；anti-p22phox抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex 公司，批號(hào)：GTX133970；antigp91phox抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab129068；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)：235005；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體和二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為A0208、P0010；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)：R9NA96863。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為5 組，每組6 只。正常對(duì)照組不作處理，其余4 組參照張杰等[7]方法造模。取0.05 ml PTg 溶液（2 g/L）與CFA 按體積比1∶1 混合，乳化成油包水乳劑；取100 μg 乳化的PTg 多點(diǎn)皮下注射大鼠，作為初次免疫，第2 周起每周再取0.05 ml 注射，作為加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫4 次。造模完成后24 h，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予蒸餾水10 ml/（kg·d）灌胃，維生素D3高劑量（200 μg/L）組、維生素D3低劑量（20 μg/L）組給予10 ml/（kg·d）維生素D3灌胃，共給藥5 周。維生素D3預(yù)防（200 μg/L）組自造模開(kāi)始即給予10 ml/（kg·d）維生素D3灌胃，共給藥9周。

1.2.2 大鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥6 h 后，所有大鼠麻醉后心臟取血6 ml，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。采用ELISA 法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清TPOAb、TgAb 水平；采用羥胺法測(cè)定血清SOD 活性，采用比色法測(cè)定血清GSH-Px 活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定血清MDA 水平。

1.2.3 大鼠甲狀腺組織p22phox、gp91phoxmRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。大鼠取血后頸椎脫臼處死，解剖并迅速取出雙側(cè)甲狀腺，pH 7.4 PBS 研磨制備組織勻漿液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取各組大鼠甲狀腺組織總RNA 并合成cDNA，采用qRT-PCR 法檢測(cè)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 大鼠甲狀腺組織p22phox、gp91phox蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。取大鼠部分甲狀腺組織，加入RIPA 裂解液勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜后分別加anti-p22phox抗體和anti-gp91phox抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3 次，加入HRP 標(biāo)記二抗，室溫1 h，ECL 顯影、曝光，使用ImageJ 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)灰度分析，以GAPDH 為參照，計(jì)算p22phox、gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD t 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5 組大鼠血清TgAb 和TPOAb 水平比較 相比正常對(duì)照組，模型對(duì)照組TgAb 和TPOAb 水平均顯著升高（均P＜0.05）。相比模型對(duì)照組，維生素D3低劑量組TgAb 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TPOAb 也降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相比模型對(duì)照組和維生素D3低劑量組，維生素D3高劑量組及預(yù)防組TgAb、TPOAb 水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。相比維生素D3高劑量組，維生素D3預(yù)防組TgAb 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 5 組大鼠血清TgAb、TPOAb 水平比較（IU/ml）

2.2 5 組大鼠血清SOD、GSH-Px 活性和MDA 水平比較 相比正常對(duì)照組，模型對(duì)照組SOD、GSH-Px 活性均顯著降低，MDA 水平顯著升高（均P＜0.05）。相比模型對(duì)照組，維生素D3低劑量組、高劑量組和維生素D3預(yù)防組SOD、GSH-Px 活性均顯著升高，MDA 水平均顯著降低（均P＜0.05）。與維生素D3低劑量組比，維生素D3高劑量組SOD、GSH-Px 活性上升，MDA 水平下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；維生素D3預(yù)防組SOD 活性顯著升高（P＜0.05），GSH-Px 活性和MDA 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 5 組大鼠血清SOD、GSH-Px 活性和MDA 水平比較

2.3 5組大鼠甲狀腺組織中p22phox和gp91phoxmRNA 水平比較 相比正常對(duì)照組，模型對(duì)照組p22phox和gp91phoxmRNA水平均顯著升高（均P＜0.05）。相比模型對(duì)照組，維生素D3低劑量組、高劑量組和維生素D3預(yù)防組p22phox和gp91phoxmRNA 水平均顯著降低（均P＜0.05）。相比維生素D3低劑量組，維生素D3高劑量組和預(yù)防組p22phox-mRNA 水平均顯著降低（均P＜0.05），gp91phoxmRNA 水平下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 5 組大鼠甲狀腺組織p22phox、gp91phox mRNA 水平比較

2.4 5 組大鼠甲狀腺組織中p22phox和gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 相比正常對(duì)照組，模型對(duì)照組p22phox、gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.05）。相比模型對(duì)照組，維生素D3低劑量組gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），p22phox蛋白相對(duì)表達(dá)量降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；維生素D3高劑量組和維生素D3預(yù)防組p22phox、gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05）。相比維生素D3低劑量組，維生素D3高劑量組和維生素D3預(yù)防組p22phox、gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 5 組大鼠甲狀腺組織中p22phox、gp91phox蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（A：蛋白相對(duì)表達(dá)量；B：蛋白電泳圖）

3 討論

TgAb 和TPOAb 作為甲狀腺自身抗體，在HT 發(fā)病和病程進(jìn)展中具有重要作用，HT 的特征表現(xiàn)為高滴度的TgAb 和TPOAb。李心愛(ài)等[16]綜述了維生素D 與HT的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，HT 自身抗體上調(diào)可能是維生素D 水平的下降導(dǎo)致，提示補(bǔ)充維生素D 或許可降低TgAb、TPOAb 滴度。劉思琪等[17]通過(guò)Meta 分析研究了HT 患者補(bǔ)充維生素D 治療后甲狀腺自身抗體水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維生素D 補(bǔ)充治療6 個(gè)月，HT 患者TgAb、TPOAb 水平顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)EAT 大鼠TgAb 和TPOAb 水平均顯著升高，經(jīng)維生素D3干預(yù)后TgAb 和TPOAb 水平均顯著降低，且高劑量維生素D3效果優(yōu)于低劑量、提前預(yù)防給藥效果優(yōu)于正常給藥，可見(jiàn)維生素D3能通過(guò)降低HT 自身抗體滴度來(lái)減少對(duì)甲狀腺組織的破壞，延緩病程進(jìn)展。

NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）家族中，同源物NOX1-5和雙氧化酶1-2（dual oxidase1-2，DUOX1-2），擁有共同的亞基p22phox和gp91phox，是體內(nèi)活性氧的主要來(lái)源[18]。研究表明NADPH 氧化酶活性升高會(huì)產(chǎn)生過(guò)多活性氧，可引發(fā)氧化應(yīng)激損傷并導(dǎo)致人體多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-21]。因此，抑制NADPH 氧化酶的過(guò)度激活有望成為治療多種疾病的潛在作用靶點(diǎn)。徐申[22]在細(xì)菌內(nèi)毒素所致急性腎損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腎臟NADPH 氧化酶亞基gp91phox和p47phox明顯上調(diào)，維生素D3預(yù)處理能明顯抑制這種上調(diào)，并減輕細(xì)菌內(nèi)毒素引起的腎臟氧化應(yīng)激損傷。Cui 等[23]對(duì)外傷腦損傷大鼠模型給予維生素D 類(lèi)似物骨化三醇治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠海馬組織NOX2活性降低，從而減少了NOX2依賴(lài)的NADPH 氧化酶活性，減輕了大腦神經(jīng)元的損傷。本研究中EAT 模型大鼠甲狀腺組織中NADPH 氧化酶亞基p22phox和gp91phoxmRNA 水平和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，經(jīng)維生素D3干預(yù)后，兩者表達(dá)明顯受到抑制，減輕過(guò)度氧化對(duì)甲狀腺組織的損傷。提示維生素D3對(duì)HT 的治療作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶的活性而實(shí)現(xiàn)。

氧化應(yīng)激紊亂除會(huì)產(chǎn)生過(guò)量活性氧外，還與抗氧化酶活性降低、脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加及抗氧化能力的減弱密切相關(guān)。Wang 等[24]構(gòu)建了急性肝損傷和維生素D 缺乏型急性肝損傷大鼠模型，比較兩種模型的抗氧化酶水平發(fā)現(xiàn)，維生素D 缺乏組大鼠SOD 和GSHPx 活性明顯降低、MDA 水平顯著升高，導(dǎo)致該組大鼠肝酶顯著升高、肝組織壞死明顯，表明維生素D 缺乏加重了急性肝損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。劉軍等[25]對(duì)瘦素受體基因純合突變（leprdb/db，db/db）小鼠進(jìn)行了有氧運(yùn)動(dòng)治療、維生素D 治療及有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合維生素D 干預(yù)治療，觀察不同組小鼠肝臟抗氧化活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，各干預(yù)組SOD 和GSH-Px 活性均顯著升高，MDA 水平均顯著降低，表明運(yùn)動(dòng)或/和維生素D 干預(yù)能通過(guò)提高肝臟抗氧化酶活性，從而降低肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用。本研究發(fā)現(xiàn)EAT 大鼠模型抗氧化能力明顯下降，SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 水平升高；給予維生素D3治療和預(yù)防均能明顯提高抗氧化酶的活性，相比低劑量組，預(yù)防組SOD 活性明顯升高，提示維生素D3能通過(guò)增強(qiáng)抗氧化水平來(lái)糾正HT 的氧化應(yīng)激紊亂，從而發(fā)揮對(duì)甲狀腺應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，EAT 大鼠存在自身抗體水平升高和明顯的氧化應(yīng)激紊亂，補(bǔ)充維生素D3能顯著降低TgAb 和TPOAb 水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，包括下調(diào)NADPH 氧化酶亞基p22phox、gp91phoxmRNA 水平和蛋白相對(duì)表達(dá)量，減少活性氧產(chǎn)生，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，增加抗氧化能力，從而減少對(duì)甲狀腺組織的破壞和損傷，延緩自身免疫性甲狀腺炎疾病的進(jìn)展。補(bǔ)充維生素D3可為預(yù)防和治療HT提供新的思路和方法。