高效液相色譜法測定小兒咽扁顆粒中膽紅素含量*

周緒華，袁啟恒，王赟澤，張德柱，2△，張志鵬

（1.陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，陜西 商洛 711400；2.陜西盤龍醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710025；3.西安國聯(lián)醫(yī)藥技術(shù)有限公司，陜西 西安 710116）

小兒咽扁顆粒有清熱利咽、解毒止痛功效，其現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于2020 年版《中國藥典（一部）》［1］。該藥處方中有人工牛黃等8 味藥材。根據(jù)《關(guān)于牛黃及其代用品使用問題的通知》（國食藥監(jiān)注［2004］21 號）及《關(guān)于加強含牛黃等藥材中成藥品種監(jiān)督管理的通知》（國食藥監(jiān)注［2012］355 號），經(jīng)批準，將處方中的人工牛黃改為用等量的體外培育牛黃進行投料。后者具有清心、豁痰、開竅、涼肝、熄風(fēng)等作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，牛黃能通過血腦屏障，具有抑制中樞和保護大腦的作用［2］，但現(xiàn)行質(zhì)量標準中未制定2 種牛黃的質(zhì)量控制方法。膽紅素類成分是上述2 種牛黃中共有的第一大類成分，也是主要藥效成分［3］，為此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法檢測小兒咽扁顆粒中膽紅素的含量，以為該制劑的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2489型高效液相色譜儀，包括2489型紫外檢測器，Empower 3 色譜工作站（美國Waters 公司）；Evolution 201 型紫外- 可見分光光度（UV）計（美國Thermo Fisher 公司）；SQP 型分析天平（精度分別為千分之一、萬分之一、十萬分之一）；arium?pro 超純水機（德國Sartorius 公司）；KQ - 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

小兒咽扁顆粒（陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，批號分別為20190503，20190504，20191201，20191202，20191203，20210303，20210305，20210804，20210813，20210814，20210901，20210903，20210904，20210905，20210906，規(guī)格均為每袋4 g）；體外培育牛黃原料（陜西盤龍藥業(yè)集團股份有限公司，批號分別為200102，201205，210604）；膽紅素對照品［中國食品藥品檢定研究院，批號為100077-202009，含量為98.8%（HPLC法），99.4%（UV 法）］；甲醇、磷酸（85%～90%）均為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［4-5］

色 譜 柱：Thermo Scientific AcclaimTM120 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-三氯甲烷-0.1%磷酸溶液（88∶6∶6，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：450 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取膽紅素對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加三氯甲烷溶液，制成每1 mL約含6.5μg的對照品溶液。取樣品適量，研細，取約3 g，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷- 甲醇- 水- 鹽酸（90∶10∶0.3∶0.02，V/V/V/V）混合溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz；下同）處理20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用上述混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按2020 年版《中國藥典（一部）》中小兒咽扁顆粒處方及工藝，制備缺體外培育牛黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。溶液制備過程均需避光操作。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取上述3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰，且陰性對照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Bilirubin A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取膽紅素對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為3.35，5.02，6.69，8.37，10.04，13.39 μg/ mL 的系列對照品溶液，各取10μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值。以膽紅素的進樣量（X，ng）為橫坐標、膽紅素峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 5 696.831X+ 3 416.324（r= 1.000）。結(jié)果表明，膽紅素進樣量在33.47～133.89 ng 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：取2.2 項下對照品溶液適量，以信噪比（S/N）為2.17∶1和10∶1時待測成分（膽紅素）的進樣量記為檢測限和定量限。結(jié)果分別為0.05 ng和0.91 ng。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積積分值。結(jié)果膽紅素色譜峰面積積分值的RSD為0.55%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為20210305）6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值，并計算含量。結(jié)果膽紅素平均含量為每袋0.254 1 mg，RSD為5.12%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：分別依法制備對照品溶液和供試品溶液，室溫下放置0，4，8，16，24，48 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值。結(jié)果對照品溶液中膽紅素峰面積積分值的RSD為1.15%（n=6），表明其在室溫下放置48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定；供試品溶液中膽紅素峰面積積分值的RSD為1.68%（n=5），表明其在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

提取回收試驗：取陰性樣品共9 份，分別精密加入含0.095，0.189，0.284 mg 的膽紅素對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，記錄峰面積積分值，并計算提取回收率。結(jié)果均在標準規(guī)定的80%～115%［6］范圍內(nèi)，詳見表1。

表1 提取回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 膽紅素轉(zhuǎn)移率

取體外培育牛黃適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，測得其中膽紅素含量為36.0%。按其含量及處方進行計算，樣品中膽紅素的轉(zhuǎn)移率為56.92%。

2.5 樣品含量測定與限度擬訂

取各批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值，并計算含量。結(jié)果為每袋0.225～0.358 g（以膽紅素計，見表2）?？紤]批間差異、藥材差異等的影響，含量限度暫定為每袋（4 g）小兒咽扁顆粒含體外培育牛黃［以膽紅素（C33H36N4O6）計］不得少于0.214 mg。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/袋）Tab.2 Results of the content determination of bilirubin in samples（mg/bag）

3 討論

預(yù)試驗中，質(zhì)量濃度為2.26μg/mL 的對照品溶液在190～1 100 nm 波長范圍內(nèi)用UV 計掃描，結(jié)果膽紅素在453 nm 波長處有最大吸收，但在450～455 nm 波長范圍內(nèi)吸收值變化平緩；采用雙波長（450 nm和453 nm）檢測，未發(fā)現(xiàn)色譜峰面積值有明顯差異，故參照2020年版《中國藥典（一部）》，以450 nm 作為膽紅素含量測定的檢測波長。

2020 年版《中國藥典（一部）》中十香返生丸、萬氏牛黃清心丸、萬應(yīng)膠囊、小兒百壽丸、牛黃抱龍丸、六應(yīng)丸、西黃丸、安兒寧顆粒、安宮牛黃丸、局方至寶散、珠黃散、梅花點舌丸等制劑品種以膽紅素為含量測定指標，進行牛黃類藥材（包括牛黃、人工牛黃和體外培育牛黃）的質(zhì)量控制指標。色譜條件，多采用C18柱，以乙腈- 1% 醋酸溶液（95∶5，V/V）為流動相（安兒寧顆粒除外），檢測波長為450 nm。理論板數(shù)按膽紅素峰計應(yīng)不低于3 000。預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，以乙腈-1%醋酸（95∶5，V/V）為流動相時出現(xiàn)峰形不對稱情況，推測為膽紅素的3 種同分異構(gòu)體（膽紅素Ⅲα、Ⅸα 和XIIIα）不能完全分離（或完全重合）所致［7］。按文獻［4 - 5］所述，選擇C18柱，以甲醇- 三氯甲烷- 0.1%磷酸溶液（88∶6∶6，V/V/V）為流動相時，膽紅素對照品溶液出現(xiàn)3 個色譜峰且峰形較好，推測原因可能為此3種同分異構(gòu)體可達到基線分離。本研究中還發(fā)現(xiàn)，以乙腈- 1%醋酸溶液（95∶5，V/V）為流動相、三氯甲烷為溶劑的膽紅素對照品溶液，進樣量為10μL 時出現(xiàn)明顯的溶劑效應(yīng)，色譜峰分叉，即使減少進樣量至5μL，色譜峰仍有出現(xiàn)肩峰的趨勢，且方法的耐用性欠佳。綜合考慮后選擇甲醇-三氯甲烷-0.1%磷酸（88∶6∶6，V/V/V）為流動相，此3種同分異構(gòu)體能較好地分離。

膽紅素是牛黃類藥材中的主要成分，多以游離、結(jié)合和共價形式存在［8-9］，游離膽紅素易通過血腦屏障，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，是牛黃類藥材中的限量成分，因此2020年版《中國藥典（一部）》中對體外培育牛黃中游離膽紅素進行了限量檢查，以保證患者的用藥安全。體外培育牛黃中膽紅素主要以結(jié)合膽紅素和共價膽紅素形式存在，僅極少量為游離膽紅素（未超過限量標準）［3，10］。預(yù)試驗中，采用先加入10%草酸溶液后渦旋混勻，再精密加入水飽和二氯甲烷后超聲處理的方法，制得供試品溶液膽紅素色譜峰峰面積遠小于按擬訂方法制備的供試品溶液，推測該提取溶劑和提取方法中，草酸對結(jié)合膽紅素和共價膽紅素的解離及穩(wěn)定作用有限（24 h內(nèi)穩(wěn)定），可能達不到供試品中膽紅素被準確檢測的效果。其原因可能為制劑成分較復(fù)雜，提取溶劑中酸的強度和用量對結(jié)合膽紅素和共價膽紅素的解離作用及穩(wěn)定性有較大影響。本研究中發(fā)現(xiàn)，采用文獻［4］中所述的三氯甲烷-甲醇-水-鹽酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）混合液進行超聲提取，能較好地將供試品中結(jié)合膽紅素和共價膽紅素解離為游離膽紅素的作用。后續(xù)試驗將上述提取溶劑中鹽酸的比例調(diào)整為0.02，能較好地滿足穩(wěn)定性試驗要求。另外，提取方法開發(fā)中還參考文獻［11］考察了提取時間和水浴溫度的影響情況，最終確定本研究中所述的樣品提取與處理方法。

同文獻［8-16］報道的情況一致，本研究中出現(xiàn)膽紅素不穩(wěn)定的情況，發(fā)現(xiàn)即使無陽光直射，僅在有室內(nèi)照明燈光存在的環(huán)境中處理，供試品溶液在加入提取溶劑的3～5 min 內(nèi)仍會從淺黃色變成綠色，膽紅素含量測定結(jié)果降低，表明溶液中膽紅素已變質(zhì)。為保證結(jié)果的準確性，制備供試品溶液及測定過程中，宜選用棕色瓶且全程避光，或選擇光線較暗的環(huán)境進行試驗。

綜上所述，該方法操作簡便，結(jié)果準確，專屬性強，可用于制劑中體外培育牛黃的含量測定。