正交試驗(yàn)優(yōu)選麝香化瘀醒腦顆粒水提工藝*

黃 江，黃 銳，袁 淵，蒲清榮，楊思進(jìn)，白 雪，楊云芳

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

麝香化瘀醒腦方是我院國(guó)家臨床重點(diǎn)?？浦嗅t(yī)腦病團(tuán)隊(duì)治療出血性中風(fēng)病的臨床經(jīng)驗(yàn)方。該方由麝香、黃芪、三七、生大黃、桂枝、大血藤、澤瀉等藥材制成，有風(fēng)藥開竅、活血利水功效，治療出血性中風(fēng)病急性期療效較好，且安全可靠［1-5］。為方便患者服用與攜帶，我院擬將其研制成中藥顆粒劑。為充分發(fā)揮方中藥物活性成分功效，根據(jù)該制劑處方中各藥材相關(guān)的化學(xué)成分與藥理作用，對(duì)方中君藥麝香、臣藥三七（打粉）直接入藥，其余藥材以水為溶劑進(jìn)行煎煮提??；以具有瀉下利濕、逐瘀通經(jīng)功效，且與該方功效基本一致的其余藥材（除上述2 味藥材）中總蒽醌含量和干浸膏質(zhì)量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)［5-8］，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選該制劑的水提工藝參數(shù)，為其制備提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀、AUW120D 型電子天平（日本Shimadzu 公司）；QP - 01 型真空泵（天津奧特賽恩儀器有限公司）；JPGT0328型全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）；NRB17S3W 型電冰箱（日本Panasonic公司）；HH 數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；ZK072型電熱真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

大黃素對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品、大黃酸對(duì)照品、大黃素甲醚對(duì)照品、蘆薈大黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110756 - 200110，110796 -201520，110757 - 201607，110758 - 201415，110795 -201710，含 量 分 別 為96%，99.4%，99.3%，99.2%，98.3%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。麝香、黃芪、三七、大黃、桂枝、大血藤、澤瀉藥材飲片（瀘州寶光醫(yī)藥有限公司，批號(hào)分別為19052001，191202，191102，190701，200101，190402，191001）。

2 方法與結(jié)果

2.1 干浸膏質(zhì)量測(cè)定

按麝香化瘀醒腦方處方比例稱取黃芪、生大黃、桂枝、大血藤、澤瀉等5 味中藥材飲片9 份，提取，濾過、濃縮，加甲酸定容至500 mL（相當(dāng)于原藥材46 g）。精密量取提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至膏狀，105 ℃干燥至恒重，置干燥器中30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干浸膏質(zhì)量（g）［9］。

2.2 總蒽醌含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：UltimateTMC18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）；流速：1 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1mL 含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素各80μg，大黃素甲醚40μg 的單一對(duì)照品溶液，各精密量取2 mL，混勻，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取2.1 項(xiàng)下提取液適量，以甲醇定容至500 mL，濾過。精密吸取續(xù)濾液5 mL置燒瓶中，水浴揮干，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲（功率350 W，頻率35 kHz；下同）處理2 min，加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：稱取處方量麝香化瘀醒腦顆粒陰性樣品（不含大黃），按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無干擾，理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000［10］，專屬性良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Aloe emodin 2.Rhein 3.Emodin 4.Chrysophanol 5.Emodin methyl ether A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，4，8，12，16，32μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的回歸方程分別為Y1=4 991.2X1- 35.6（R2= 0.999 8）、Y2= 3 476.4X2-37.3（R2= 0.999 7）、Y3= 5 610.2X3- 22.4（R2=0.999 9）、Y4= 4 079.3X4- 33.7（R2= 0.999 9）、Y5=869.4X5-69.5（R2=0.999 8）。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚進(jìn)樣量均在0.016 ～0.512μg范圍內(nèi)，大黃素甲醚在0.008 ～0.256 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.15%，1.25%，1.33%，1.27%，0.66%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.01%，0.59%，1.09%，1.46%，1.29%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一提取液6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.35%，1.51%，1.53%，1.36%，1.25%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品9 份，每份約5 g，精密稱定，分別按其中所含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的50%，100%，150%，加入各單一對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗(yàn)：取同一供試品溶液適量，分別在色譜條件一定波動(dòng)范圍［流速（0.8± 0.2）mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)（254±2）nm，柱溫（40±5）℃］內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為0.73%，0.65%，1.01%，1.12%，1.05%，表明該色譜條件小范圍變化時(shí)本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選水提工藝

根據(jù)處方中各藥物性質(zhì)，麝香、三七（打粉）直接入藥，其余藥物采用傳統(tǒng)的水煎煮法提取。以加水量（因素A）、浸泡時(shí)間（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）為考察因素，以干浸膏質(zhì)量與總蒽醌含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提工藝參數(shù)。綜合評(píng)分=［（干浸膏質(zhì)量/干浸膏質(zhì)量最大值）× 0.5 +（總蒽醌含量/總蒽醌含量最大值）×0.5］×100［11-12］。因素與水平見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

由表3可知，各因素對(duì)水提工藝綜合評(píng)分的影響順序?yàn)镈 ＞A ＞C ＞B，最佳工藝組合為A3B1C3D2。由表4可知，各因素對(duì)結(jié)果均有顯著影響。綜合考慮提高生產(chǎn)效率與節(jié)約能耗等因素，最終優(yōu)化提取工藝為A2B1C1D2，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1.0 h。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Deign and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the ANOVA

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按選定的最佳工藝進(jìn)行3 次提取試驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定。詳見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the validation test

3 討論

本研究中根據(jù)麝香化瘀醒腦方中各藥材藥理活性特點(diǎn)等信息，同時(shí)考慮我院制劑生產(chǎn)特點(diǎn)，將方中麝香、三七（打粉）直接入藥，黃芪、大黃等5味藥材進(jìn)行水提。以提取液作為黏合劑，以糊精為輔料，加入三七粉、麝香，采用濕法制粒法制粒，干燥、整粒即得麝香化瘀醒腦顆粒［11-12］。提取工藝為藥物制劑的關(guān)鍵因素，因此本研究中采用正交試驗(yàn)研究麝香化瘀醒腦顆粒的提取工藝，綜合比較各因素對(duì)提取效果的影響程度，并研究各因素的主次及相互作用，從而確定最優(yōu)提取工藝條件［13］。

麝香化瘀醒腦顆粒中，大黃具有瀉下利濕、逐瘀通經(jīng)功效，與麝香化瘀醒腦顆粒組方原理基本一致，故筆者根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇大黃有效成分總蒽醌含量及干浸膏質(zhì)量各占50%權(quán)重的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)［14-15］控制質(zhì)量，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選麝香化瘀醒腦顆粒水提工藝參數(shù)，并經(jīng)驗(yàn)證其參數(shù)穩(wěn)定、可靠。測(cè)定大黃總蒽醌含量的高效液相色譜（HPLC）法及色譜條件參考了2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中大黃藥材項(xiàng)下相關(guān)內(nèi)容，結(jié)果分離效果好且峰形不拖尾，能較好地將5 種蒽醌類物質(zhì)分離。綜上所述，本研究中優(yōu)化的工藝操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，可用于麝香化瘀醒腦顆粒的水提。建立的HPLC法快速，靈敏度、準(zhǔn)確度高，可為麝香化瘀醒腦顆粒生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制及其后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。