仙草家園山豬肉對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠骨髓抑制的改善

劉嘉瑩，劉瑩，李育銀，梁曉文，章力建，黃松*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院（廣州 440100）；2.廣州市天下農(nóng)王農(nóng)業(yè)有限公司（廣州 440100）；3.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專家委員會(huì)（北京 110000）

豬肉是日常食物中的重要營(yíng)養(yǎng)來源[1]。據(jù)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在豬肉中含有鈣、鈉和鐵等微量元素，鐵在豬肉中的含量較高，可有效補(bǔ)充人體紅細(xì)胞的生成和功能維持所需[2]。豬肉中含有豐富的蛋白質(zhì)，這也是豬肉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，且豬肉的氨基酸與人類的氨基酸相似，更有利于營(yíng)養(yǎng)吸收[3]。高蛋白的食物也可以補(bǔ)充身體的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)而提高身體的免疫力。但現(xiàn)階段廣大消費(fèi)者對(duì)于豬肉的需求不再停留在量上，逐漸開始對(duì)豬肉的品質(zhì)有了更高要求。豬肉品質(zhì)的影響因素中自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要包括豬肉中微量元素、蛋白質(zhì)和糞臭素等方面，同時(shí)飼料營(yíng)養(yǎng)因素也是影響豬肉品質(zhì)的重要因素。有眾多學(xué)者報(bào)道以中藥為飼料添加劑的豬肉中的中藥具有不易產(chǎn)生耐藥性，低或無殘留和毒性的飼料添加劑，在畜禽生產(chǎn)中還具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)的應(yīng)用[4]。因此，以中藥飼料為添加劑的山豬肉的品質(zhì)比市售豬肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。

豬肉性平、味甘、咸、無毒；入脾、胃、腎經(jīng)；主要有補(bǔ)腎養(yǎng)血、滋陰潤(rùn)燥之功效。治療病后體弱，產(chǎn)后血虛，皆可作為補(bǔ)益食療之品[5]。因此，豬肉往往是癌癥患者康復(fù)時(shí)的補(bǔ)益食療之品。臨床上，癌癥患者多采用化療藥環(huán)磷酰胺進(jìn)行治療，化療藥環(huán)磷酰胺在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)殺傷正常細(xì)胞[6-8]，尤其是骨髓細(xì)胞受化療藥的損傷嚴(yán)重，骨髓抑制也是化療藥對(duì)患者的人體機(jī)能帶來嚴(yán)重不良影響之一[9]。因此，豬肉有助于改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制。

以中藥為飼料添加劑的豬肉對(duì)機(jī)體骨髓抑制改善的相關(guān)報(bào)道極少，因此，試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺化療藥誘導(dǎo)建立骨髓抑制的小鼠模型。觀察仙草家園山豬肉在骨髓抑制方面的改善作用，為仙草家園山豬肉的生產(chǎn)及推廣提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，助力養(yǎng)豬畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并為以中藥飼料為添加劑豬肉的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品組為仙草家園山豬肉，由廣州市仙草家園科技有限公司生產(chǎn)企業(yè)提供；對(duì)照組為市售豬肉。

KM小鼠144只：6～8周齡，雌雄各半，SPF級(jí)，體重20±2 g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證明SCXK（粵）2020-0051，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)大學(xué)（大學(xué)城）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；環(huán)磷酰胺粉劑（17011325，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）；生理鹽水（3B15092607，山東齊都藥業(yè)有限公司）；鈣（Ca）試劑盒（C004-2-1）、堿性磷酸酶（ALP/AKP）測(cè)定試劑盒（A059-2-2）、磷（Pi）測(cè)試盒（C006-1-1）、銅（Cu）測(cè)定試劑盒（E010-1-1）、鋅（Zn）試劑盒（E011）：南京建成生物科技公司；鐵（Fe）試劑盒（TC1015，雷根生物有限公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（大連美侖生物科技有限公司）；豬（Porcine）糞臭素（skatole）ELISA試劑盒（ZK-P9738，深圳子科生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（ME204E，Mettler Toledo公司）；電子天平（PL3001-S，Mettler Toledo公司）；冷凍高速離心機(jī)（Fresco-17，Thermo Fisher Scientific）；酶標(biāo)儀（Multiskan，Thermo Fisher Scientific）；GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司）；勻漿機(jī)（VCX 130PB，SONICS MATERIALS INC）。

1.3 樣品和對(duì)照品制備

將5 kg市售豬肉和5 kg仙草家園山豬肉分別用清水洗凈，放入鍋中加水煮熟，撈出，用吸水紙擦干表面水分，切成等量小塊，全部放入冷凍干燥機(jī)至2 d，取出，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 營(yíng)養(yǎng)成分分析

1.4.1 微量元素的測(cè)定

鈣（Ca）、銅（Cu）、鋅（Zn）的測(cè)定分別采用Ca試劑盒、Cu測(cè)定試劑盒、Zn試劑盒。

1.4.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒。

1.4.3 糞臭素的測(cè)定

采用豬（Porcine）糞臭素（skatole）ELISA試劑盒。

1.5 構(gòu)建小鼠骨髓抑制模型

參照譚麗等[10]方法稍作修改，隨機(jī)分為正常組、模型組、市售樣品低劑量組（5 g/kg）、市售樣品高劑量組（10 g/kg）、仙草家園樣品低劑量組（5 g/kg）、仙草家園樣品高劑量組（10 g/kg）。其中，12只作為正常對(duì)照鼠，剩余小鼠腹腔注射化療藥環(huán)磷酰胺注射40 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射5 d，根據(jù)前期研究，造模第5天骨髓抑制模型成立。后續(xù)減少注射至20 mg/kg，隔天1次，連續(xù)注射至15 d后，停止藥物的注射。

1.6 脾臟和胸腺指數(shù)測(cè)定

連續(xù)喂養(yǎng)豬肉25 d后禁食不禁水；24 h后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器表面的血漬，稱重記數(shù)，計(jì)算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。按式（1）計(jì)算。

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體重（g）（1）

1.7 血常規(guī)含量測(cè)定

小鼠摘眼球取血，取50 μL用抗凝管儲(chǔ)存，采用全自動(dòng)血生化儀檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）。

1.8 血清中Ca、P、AKP含量測(cè)定

試驗(yàn)前小鼠禁食24 h，禁食期間自由飲水。隨后采用麻醉劑麻醉動(dòng)物并眼眶靜脈中取血，全血靜止2 h后于3 500 r/min（-4 ℃）低溫離心15 min，取上層血清于-80 ℃保存，用于后續(xù)Ca、P、AKP指標(biāo)檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以±S表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)成分分析

2.1.1 微量元素成分分析

表1 微量元素成分分析

微量元素成分分析結(jié)果見圖1。仙草家園組與市售組相比，豬肉中鈣離子含量有明顯增加，有顯著差異（P＜0.05），其他Fe、Zn、Cu均無明顯差異。這可能與仙草家園中藥飼料含有強(qiáng)健筋骨的中草藥有關(guān)。

2.1.2 蛋白質(zhì)和糞臭素成分分析

蛋白質(zhì)成分分析結(jié)果見圖2。仙草家園組在豬肉中總蛋白質(zhì)含量方面均顯著高于市售組，有顯著差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明仙草家園樣品組在蛋白質(zhì)含量方面較市售組更優(yōu)。優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)可以提高生物體的免疫力，提示仙草家園樣品組可能在在免疫調(diào)節(jié)方面更優(yōu)于市售組。仙草家園豬苗采用中藥飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其豬肉糞臭素的含量明顯低于市售豬肉，提示中藥飼料喂養(yǎng)后可能通過改善豬體內(nèi)腸道菌群平衡從而改善豬肉膻味。

2.2 脾臟和胸腺指數(shù)測(cè)定

由表3可知，模型組雄鼠脾臟指數(shù)明顯升高，與正常組相比差異極顯著（P＜0.01），提示環(huán)磷酰胺對(duì)雄鼠脾臟器官有顯著的抑制作用，即環(huán)磷酰胺致雄鼠骨髓抑制模型構(gòu)建成功。市售組和仙草家園組均可使骨髓抑制雄鼠的脾臟指數(shù)降低，說明2種豬肉均可以抑制脾臟腫大，即2種豬肉對(duì)骨髓抑制雄鼠脾臟指數(shù)有很強(qiáng)的恢復(fù)促進(jìn)作用。市售組和仙草家園組均可極顯著降低脾臟指數(shù)（P＜0.01），與市售組相比，仙草家園組降低脾臟指數(shù)更明顯，與正常組脾臟指數(shù)的數(shù)據(jù)更接近，說明仙草家園組較市售組對(duì)脾臟指數(shù)的恢復(fù)有更好的促進(jìn)作用。

表3 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠脾臟指數(shù)的影響（±S，N=12）

表3 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠脾臟指數(shù)的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) 脾臟指數(shù)/(mg·g-1)雄正常組 - 2.42±0.33模型組 - 5.47±4.01##市售低劑量組 5 3.55±2.57**市售高劑量組 10 4.22±2.56**仙草家園低劑量組 5 3.21±1.61**仙草家園高劑量組 10 3.48±0.88**雌 正常組 - 3.18±0.73模型組 - 5.01±2.54##市售低劑量組 5 4.48±2.35市售高劑量組 10 5.16±1.36仙草家園低劑量組 5 3.53±0.56**仙草家園高劑量組 10 3.35±0.68**注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較,*表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

另外，模型組雌鼠脾臟指數(shù)明顯升高，與正常組相比差異極顯著（P＜0.01），提示環(huán)磷酰胺對(duì)雌鼠脾臟器官有顯著的抑制作用，即環(huán)磷酰胺致雄鼠骨髓抑制模型構(gòu)建成功。市售組和仙草家園組均可使免疫抑制雌鼠的脾臟指數(shù)的降低，市售組對(duì)免疫抑制雌鼠的脾臟指數(shù)的降低無明顯差異，仙草家園組對(duì)免疫抑制雌鼠的脾臟指數(shù)的降低有極顯著差異（P＜0.01），表明仙草家園組較市售組在骨髓抑制方面上有更好干預(yù)作用。

2.3 血常規(guī)含量測(cè)定

雄鼠中，與模型組相比，市售豬肉劑量組和仙草家園樣品劑量組RBC、HGB、PLT有升高趨勢(shì)，均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在WBC指標(biāo)中，仙草家園高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與市售組相比，在WBC、RBC、HGB、PLT這4個(gè)指標(biāo)中，仙草家園產(chǎn)品組改善效果更明顯，表明仙草家園產(chǎn)品能夠從體內(nèi)相比市售組能更好改善骨髓抑制。

另外，雌鼠中，與模型組相比，各劑量組的升高的趨勢(shì)與雄鼠中的指標(biāo)相似，這可能與豬肉中具有豐富的半胱氨酸，以及血紅素可顯著改善貧血等相關(guān)。此外，與市售組相比，仙草家園樣品組升高的趨勢(shì)更加明顯，表明仙草家園樣品組可能具有比市售組更強(qiáng)的改善效果。

表4 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠外周血細(xì)胞含量測(cè)定的影響（±S，N=12）

表4 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠外周血細(xì)胞含量測(cè)定的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) WBC/(109·L-1) RBC/(1012·L-1) HGB (g·L-1) PLT/(109·L-1)雄正常組 - 5.7±0.73 8.13±0.36 128.86±18.86 1 503.50±259.18模型組 - 3.4±0.77# 4.36±0.97## 92.22±5.07## 1 015.56±87.89##市售低劑量組 5 3.76±1.48 6.38±0.35** 108.00±4.82** 1 184.25±113.24*市售高劑量組 10 4.64±1.80 6.81±0.86** 111.89±9.39** 1 278.22±156.86**仙草家園低劑量組 5 4.96±1.86 7.03±0.63** 117.15±4.81** 1 242.00±102.51**仙草家園高劑量組 10 4.78±1.14* 6.63±0.39** 121.25±2.94** 1 363.30±91.84**雌正常組 - 5.60±1.79 7.03±0.36 128.17±20.09 1 503.44±192.89模型組 - 2.51±0.65## 4.60±0.97## 92.22±5.12## 1 183.13±46.37##市售低劑量組 5 3.31±0.69 6.11±0.35** 111.80±3.09 1 015.25±100.43*市售高劑量組 10 4.55±1.18** 6.39±0.58** 117.00±8.18* 1 175.56±87.93仙草家園低劑量組 5 4.12±0.71* 7.07±0.33** 116.10±31.29** 1 229.73±127.79仙草家園高劑量組 10 4.94±1.49** 7.16±0.67** 118.90±6.07** 1 415.20±124.78**注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

2.4 血清中Ca、AKP、P含量測(cè)定

與模型組相比，雄鼠各劑量組的Ca含量均有升高趨勢(shì)，其中仙草家園樣品高劑量組血清中Ca含量最高，達(dá)9.76 mg/100 mL，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最明顯（P＜0.01）。另外，與模型組相比，雄鼠的市售高劑量組和仙草家園樣品組均有升高趨勢(shì)，其中仙草家園樣品低劑量組的AKP含量最高，達(dá)13.36金氏單位/100 mL，有極顯著差異（P＜0.01）。在P含量指標(biāo)上，正常組和模型組沒有產(chǎn)生明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），市售組與模型組無明顯差異，仙草家園樣品組比市售組的干預(yù)效果更好。

另外，雌鼠中與模型組相比，各劑量組的Ca含量均有升高趨勢(shì)，其中仙草家園樣品高劑量組Ca含量最高，達(dá)9.44 mg/100 mL，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異最明顯（P＜0.01）。另外，與模型組相比，雌鼠AKP含量的市售高劑量組和仙草家園樣品組有明顯差異，其中仙草家園樣品高劑量組AKP含量最高，達(dá)13.40金氏單位/100 mL。

表5 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠血清Ca、AKP、P含量的影響（±S，N=12）

表5 兩種豬肉對(duì)骨髓抑制雄性和雌性小鼠血清Ca、AKP、P含量的影響（±S，N=12）

類別 組別 劑量/(g·kg-1) Ca/(mg·100-1 mL) AKP/(金氏單位·100-1 mL) P/(mg·100-1 mL)雄正常組 - 9.59±1.43 17.80±1.83 11.26±2.34模型組 - 6.27±0.84## 8.61±1.25## 8.75±1.01市售低劑量組 5 7.29±0.71 8.83±1.83 8.70±0.85市售高劑量組 10 7.83±0.76* 10.40±1.99 8.56±1.18仙草家園低劑量組 5 7.77±0.76* 13.36±2.68** 10.38±1.44仙草家園高劑量組 10 9.76±0.99** 11.80±1.51* 10.61±1.70雌正常組 - 9.39±1.28 14.27±1.81 11.00±1.29模型組 - 5.00±1.03## 8.76±1.49## 10.35±1.87市售低劑量組 5 6.00±0.97 10.26±1.83 10.61±2.14市售高劑量組 10 7.56±0.83* 12.74±1.43** 9.27±0.93仙草家園低劑量組 5 7.04±1.24 11.41±0.89* 10.96±1.26仙草家園高劑量組 10 9.44±0.99** 13.40±1.59** 9.39±1.81注: 與空白組比較, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01; 與模型組比較, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01 (n=12)。

3 討論

試驗(yàn)表明，仙草家園產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的以中藥為飼料添加劑的豬肉，與市售豬肉相比，在體外試驗(yàn)對(duì)2種豬肉微量元素、蛋白質(zhì)比例和糞臭素指標(biāo)的測(cè)定上，仙草家園山豬肉比市售豬肉的Ca含量、豬肉的蛋白質(zhì)含量更高，糞臭素含量更低，改善豬肉的膻味，表明仙草家園山豬肉比市售豬肉的口感更好、蛋白質(zhì)更豐富、補(bǔ)鈣效果更強(qiáng)，根據(jù)豬肉Ca含量和蛋白質(zhì)含量的結(jié)果猜想仙草家園山豬肉可能對(duì)骨髓抑制有較好的干預(yù)效果。因此，建立由化療藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制的模型組，分別用2種豬肉進(jìn)行喂養(yǎng)。

何丹[11]用戊二醛聚合豬血紅蛋白（pPolyHb），可以提高貧血?jiǎng)游镅t蛋白含量，通過測(cè)定外周血細(xì)胞的含量，從而改善化療藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制。試驗(yàn)結(jié)果顯示仙草家園樣品組可以提高化療藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制小鼠的外周血細(xì)胞中WBC、RBC、HGB、PLT和降低脾臟指數(shù)，抑制脾臟腫大，且比市售豬肉組有更好的干預(yù)效果。

骨髓抑制往往也會(huì)帶來骨質(zhì)疏松的影響，因此會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的Ca和AKP含量的流失[12]。同時(shí)，仙草家園山豬肉可以提高化療藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制小鼠的Ca含量和AKP含量，且比市售豬肉的干預(yù)效果更好，對(duì)骨頭的發(fā)育有更好促進(jìn)作用。這提示中藥對(duì)豬肉品質(zhì)的改善作用，同時(shí)在日常食用中對(duì)健康方面具有一定保護(hù)作用。同時(shí)，也說明仙草家園山豬肉比市售豬肉對(duì)骨髓抑制的改善效果更強(qiáng)。

通過聚焦于以中藥飼料喂養(yǎng)的仙草家園山豬肉，探究仙草家園山豬肉與市售豬肉對(duì)化療藥環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓抑制的不同改善作用。進(jìn)一步為養(yǎng)豬畜牧業(yè)研發(fā)與推廣提供科技支持。但仍有很多需要繼續(xù)深入研究的內(nèi)容，仙草家園山豬在體改善骨髓抑制的具體機(jī)制還有待深入探討。為明確仙草家園山豬對(duì)骨髓抑制的作用機(jī)制，有待對(duì)仙草家園山豬對(duì)小鼠體外細(xì)胞中各骨髓抑制指標(biāo)的影響及仙草家園山豬中各有效物質(zhì)的作用機(jī)制等開展深入研究。