桃金娘多酚的響應(yīng)面優(yōu)化提取及抗氧化活性研究

徐艷，邱元凱，何歡，羅文敏，方廣平，駱瑋詩*

1.河源職業(yè)技術(shù)學(xué)院（河源 517000）；2.河源市吉龍翔生物科技有限公司（河源 517000）

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）又稱為稔子、山稔及烏肚子，是一種常綠花多的小灌木，屬于桃金娘科桃金娘屬植物，主要分布于中國南部，如臺灣、廣西、廣東、云南、湖南等地。桃金娘抗逆性強(qiáng)，常生長在貧瘠的丘陵坡地，是一種優(yōu)良的藥食同源類野生植物資源。桃金娘性味甘澀平，以根、葉和果入藥，具有養(yǎng)血、止血、澀腸、固精之功效[1]，其果實中含有三萜類、黃酮類、鞣酸（單寧、多酚）類、多糖類及色素類化學(xué)成分[2]。國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)表明，桃金娘具有很高的抗氧化活性，每克桃金娘的DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）與28.5 μmol沒食子酸、67.2 μmol抗壞血酸（VC）[3-4]相當(dāng)。桃金娘具備諸多生物活性，包括抗病毒、抗菌與抗氧化等[5-12]，體現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價值，是應(yīng)用開發(fā)價值較高的一類野生資源。相關(guān)研究顯示，桃金娘總酚含量很高，這決定了其果實抗氧化活性較高[13]。因此，對桃金娘多酚提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高多酚提取量，對桃金娘抗氧化活性相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃金娘果實干貨（烘干后粉碎，過0.150 mm孔徑篩，即100目）。

沒食子酸對照品（含量≥98%）、無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚試劑、無水甲醇、DPPH、ABTS（2, 2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、VC、草酸（均為國藥集團(tuán)產(chǎn)品）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV1700紫外-可見分光光度計（日本島津）；Mil-li-Q超純水儀（Millipore公司）；F160型粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；FA2004B分析天平（精度0.000 1 mg，上海佑科公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過沒食子酸的當(dāng)量（GAE）表示總多酚含量（mg GAE/g，干質(zhì)量）。分別將質(zhì)量濃度皆為1.0 mg/mL但體積不同的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液移入容量瓶（50 mL）內(nèi)，分別吸量1 mL稀釋液放到比色管（10 mL）內(nèi)，添加5 mL去離子水，加入1 mL的福林酚顯色劑（1∶9，V/V），搖勻，添加3 mL的Na2CO3溶液（7.5%），避光靜置1 h后，進(jìn)行最大吸收波長掃描[14-15]，得到的最大吸收波長為754 nm，測定待測溶液的A754nm。以橫坐標(biāo)為多酚質(zhì)量濃度（以沒食子酸計），縱坐標(biāo)為A754nm進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，獲得多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見式（1）。

式中：x為多酚質(zhì)量濃度（以沒食子酸計），μg/mL；y為所對應(yīng)的吸光度（A754nm）。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

逐一考察處理溫度、料液比、提取時間、無水乙醇體積分?jǐn)?shù)等單因素影響桃金娘多酚提取量狀況。提取步驟：準(zhǔn)確稱取2.0 g相同批次的桃金娘果實粉末，設(shè)置不同料液比（1∶70～1∶120 g/mL），分別添加不同體積分?jǐn)?shù)溶劑（30%～80%），在不同溫度（50～100℃）進(jìn)行不同時間（0.5～3.0 h）的提取，并逐一抽濾，并收集上清液作為提取液，精準(zhǔn)吸量1 mL提取液，稀釋至10 mL，計算不同條件下的桃金娘多酚提取率。

在單因素試驗基礎(chǔ)上對4個影響因素進(jìn)行篩選，選出對多酚提取效果具有顯著影響的3個因子，為響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計提供基礎(chǔ)。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果，數(shù)據(jù)分析所用工具為Box-Behnken，將桃金娘多酚提取量作為響應(yīng)值，選取存在較顯著影響的3項因素，即提取溫度、料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)開展響應(yīng)面分析，圍繞工藝條件開展三因素三水平試驗設(shè)計，對提取桃金娘多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計情況如表1所示。

1.3.4 桃金娘多酚提取物體外抗氧化活性的測定

按照確定的最優(yōu)提取條件提取桃金娘多酚，并對提取物進(jìn)行抗氧化活性評價分析。

1.3.4.1 ABTS+·清除能力測定[15]

取多酚提取液溶液配制成不同質(zhì)量濃度的溶液待測。吸取不同濃度樣品溶液2和8 mL ABTS工作液，振蕩10 s，徹底混合，經(jīng)過6 min靜置，檢測A730nm，平行測定3次，ABTS+·清除能力見式（2）。

式中：A0為樣品空白吸光度：Ai為樣品吸光度；Aj為樣品本底吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定[16]

分別取3 mL不同濃度水平的樣品液，同時添加3 mL的DPPH乙醇溶液（0.16 mmol/L），置于25 ℃水浴鍋中加熱15 min，對不同濃度水平的樣品液A517nm（Ai）進(jìn)行測量。同時，測量樣品本底吸光度（Aj）與空白吸光度（A0），通過式（3）對DPPH消除率進(jìn)行求解。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

各項試驗皆進(jìn)行3遍重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)的整理繪圖借助軟件Origin 2018完成，在數(shù)值的PCA主成分分析方面，應(yīng)用的軟件為past，借助軟件JMP 10.0完成響應(yīng)面試驗的設(shè)計及整理繪圖工作，采取方差分析（ANOVA），差異顯著的要求為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃金娘果實多酚提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對桃金娘多酚提取量的影響

當(dāng)提取時間2 h，溫度80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時，考察料液比對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（a）所示。料液比在1∶70～1∶110（g/mL）的范圍內(nèi)，提取量與乙醇添加量正相關(guān)，料液比1∶110（g/mL）時可獲得最大多酚含量22.90 mg GAE/g，繼續(xù)增加溶劑含量多酚提取量開始降低，可見此時已無多酚物質(zhì)溶出。所以，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中，設(shè)定料液比1∶80～1∶120（g/mL）。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對桃金娘多酚提取量的影響

當(dāng)提取時間2 h，溫度80 ℃，料液比1∶110（g/mL）時，考察浸提溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（b）所示。增加乙醇體積分?jǐn)?shù)后，桃金娘多酚提取量大幅提高，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～50%時，桃金娘多酚提取量達(dá)到最高的29.45 mg GAE/g，繼續(xù)增加溶劑體積分?jǐn)?shù)，多酚提取量開始明顯降低。此外，若乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，會提高分離純化難度，同時導(dǎo)致資源浪費，所以，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)30%～70%。

2.1.3 提取時間對桃金娘多酚提取量的影響

當(dāng)料液比1∶110（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取溫度80 ℃時，考察提取時間對桃金娘多酚提取量的影響，如圖1（c）所示。提取時間從0.5～1.5 h，桃金娘多酚提取量有少量提升，繼續(xù)延長提取時間，桃金娘多酚提取量基本穩(wěn)定并有少許下降，在1.5 h時達(dá)到最高的30.29 mg GAE/g，僅比最低提取量提升6.92%，說明提取時間對桃金娘多酚的影響不顯著，結(jié)合節(jié)省能源的考慮，設(shè)定提取時間1 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.4 提取溫度對桃金娘多酚提取量的影響

當(dāng)料液比1∶110（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取時間60 min時，考察提取溫度影響桃金娘多酚提取量狀況，如圖1（d）所示。在提取溫度提高的前提下，桃金娘多酚提取量有明顯增加，并在90 ℃時達(dá)到最大的31.19 mg GAE/g，繼續(xù)增加提取溫度，桃金娘多酚提取量開始降低，這可能是因為高溫容易引起多酚類物質(zhì)的分解，因此，在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中設(shè)定提取溫度60～100 ℃。

圖1 單因素試驗結(jié)果

為進(jìn)一步優(yōu)化最佳提取條件，采取響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計從4個單因素中篩選出顯著影響的3個因素，圖1根據(jù)多酚提取量的變化明顯可以看出，4個影響因素中的提取時間屬于不顯著影響的因素，因此把乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與料液比設(shè)置為后續(xù)響應(yīng)面試驗的因素，其試驗水平見表1。

2.2 提取桃金娘果實多酚的響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計所用工具為Box-Behnken，優(yōu)化同時確定多因素系統(tǒng)中最優(yōu)測試條件，具體試驗設(shè)計詳情如表2所示，其中各模式皆安排3次平行試驗，將均值作為終值。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

借助軟件JMP 10.0對表2所示各條件下試驗數(shù)據(jù)實施擬合，獲得多酚提取量對乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、溫度水平（X2）與料液比（X3）的RM（回歸模型）方程：多酚提取量=31.40-1.27X1-1.59X2-0.35X3+0.55X1X2+0.50X1X3-0.16X2X3-3.43X12-4.55X22-1.02。

由表3可知，RM存在高度的顯著水平（P值為0.000 7，在0.001以下），失擬項缺乏顯著性（P=0.150 4＞0.05），R2為0.982 6，Radj2為0.951 1，可見此模型試驗誤差不明顯，具良好擬合度，可以呈現(xiàn)響應(yīng)值的變化，能通過該方程模型分析與預(yù)測乙醇浸提法進(jìn)行桃金娘果實多酚提取的工藝參數(shù)。回歸模型顯著性檢驗結(jié)果顯示，X1、X2、X12、同多酚提取量存在極顯著聯(lián)系（P＜0.01），X32同多酚提取量存在顯著聯(lián)系（P＜0.05）?；贔值，各個因素同桃金娘多酚提取量相關(guān)性程度由重至輕排序為提取溫度（X2）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）＞料液比（X3）。

兩兩因素交互效應(yīng)響應(yīng)面如圖2所示。各因素交互效應(yīng)響應(yīng)面開口皆向下，可見在各因素增大的同時，響應(yīng)面值皆為提升表現(xiàn)，待至最大值又慢慢下降。響應(yīng)面坡面愈陡峭，表示試驗因素對桃金娘果實多酚提取量影響于顯著，反之其愈平緩，試驗因素的影響則愈弱；乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度兩因素間的交互效應(yīng)響應(yīng)面坡面最陡峭，且從表3的兩兩交互作用的顯著性檢驗數(shù)據(jù)也可得知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的相關(guān)性稍強(qiáng)于其他因素間的組合，由等高線分析發(fā)現(xiàn)，就影響多酚提取程度而言，提取溫度較強(qiáng)，料液比則較弱。

表3 多酚提取量為響應(yīng)值的方差分析

圖2 以多酚提取量為指標(biāo)的響應(yīng)面圖

2.2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化及驗證試驗

經(jīng)JMP 10.0軟件模型分析，預(yù)測桃金娘果實多酚最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)45.71%、提取溫度76.30℃、料液比1∶95.78（g/mL），此時理論多酚提取量為31.715 6 mg GAE/g?；趯嶋H操作，對提取桃金娘果實內(nèi)多酚的工藝做出設(shè)計：料液比1∶95（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度76 ℃，此條件下實施3次平行試驗，計算桃金娘多酚提取量，均值是32.58±0.24 mg GAE/g，結(jié)果與預(yù)測的理論相近，且高于正交試驗中各試驗的提取量，表明模型擬合良好，最佳工藝合理，參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 桃金娘果實多酚的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS+·活性

試驗結(jié)果顯示桃金娘果實多酚具有很高的ABTS+·清除能力，與抗壞血酸的清除效果接近（見圖3）。增加桃金娘果實提取的多酚樣品對ABTS+·清除率表現(xiàn)為先升高再趨于平穩(wěn)，濃度和活性存在正相關(guān)，多酚質(zhì)量濃度超過25 μg/mL后，仍保持98.4%的高清除率。而陽性對照中抗壞血酸濃達(dá)到20 μg/mL后，清除率活性穩(wěn)定并達(dá)到100%。通過Origin 2018軟件擬合，桃金娘多酚對ABTS+·的半抑制濃度（IC50）為10.93 μg/mL，對照品VC的IC50為8.52 μg/mL，這一結(jié)果顯示，根據(jù)前期條件優(yōu)化試驗獲得的桃金娘多酚樣品有很好的清除ABTS+·能力，與同濃度的抗壞血酸效果相近。

圖3 桃金娘多酚對ABTS+·清除作用

2.3.2 清除DPPH自由基活性

試驗結(jié)果顯示，桃金娘多酚清除DPPH的能力較強(qiáng)（見圖4）。桃金娘果實提取的多酚濃度與其對DPPH清除率也符合正相關(guān)量效關(guān)系，待質(zhì)量濃度超過10.75 μg/mL后保持83.77%左右的DPPH清除率，略低于對照品抗壞血酸的清除活性（93.79%），經(jīng)Origin 2018軟件擬合，對于自由基DPPH，桃金娘多酚的IC50為4.47 μg/mL（對照品VC的IC50為1.12 μg/mL）。對于自由基DPPH，桃金娘多酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，約為濃度相當(dāng)時VC清除DPPH能力的89.3%。

3 結(jié)論

在使用乙醇浸提法提取桃金娘果實多酚的單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計軟件確定的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取溫度76 ℃、料液比1∶95（g/mL），所得桃金娘多酚提取量為32.58±0.24 mg GAE/g。通過比較不同濃度下的桃金娘多酚與對照品維生素C體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，對于ABTS+·與DPPH，桃金娘多酚皆表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除活性，抗氧化能力接近維生素C的水平，其清除ABTS+·自由基、DPPH自由基半抑制濃度（IC50）分別為10.93和4.47μg/mL。試驗結(jié)果可為野生桃金娘多酚的進(jìn)一步開發(fā)利用及抗氧化活性產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。