響應面法優(yōu)化牡丹籽粕蛋白提取工藝及其功能性質(zhì)

陳晨，李成忠*，張煥新，王宇麟

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院（泰州 225300）

牡丹是屬于毛茛科和牡丹科的落葉灌木植物[1]，具有重要的觀賞價值、食用價值及藥用價值。牡丹籽含油量20%以上，其亞麻酸和亞油酸含量豐富，可加工成調(diào)和油，同時還可加工成各種食品、保健品[2]。牡丹籽榨油后產(chǎn)生大量牡丹籽粕，約占牡丹籽總量的80%。牡丹籽粕中蛋白質(zhì)含量在20%～30%[3-4]，具有合理的氨基酸組成和良好的功能特性，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[5]，可應用于食品工業(yè)或化妝品行業(yè)，不僅能夠大幅提高牡丹籽副產(chǎn)物的綜合利用率，提高產(chǎn)品的附加值，還能處理好牡丹籽粕廢棄引起的資源浪費與環(huán)境問題。

試驗在堿提酸沉基礎上，利用超聲輔助酶法提取牡丹籽粕蛋白，利用響應面法優(yōu)化工藝條件，并分析蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，以期為牡丹籽粕蛋白綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹籽粕：將牡丹籽脫殼后，使用高速粉碎機粉碎，經(jīng)石油醚脫脂后于50 ℃熱風干燥箱中烘干，過0.250 mm孔徑（60目）篩備用；石油醚（沸程60～90 ℃，上海沃凱生物技術有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸（分析純，上海蘇懿化學試劑有限公司）；糖化酶（活力80 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；大豆分離蛋白（鄭州莫達化工有限公司）；硼酸、甲基紅、溴甲酚綠（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

KQ-250B型超聲清洗器（南京旭析儀器有限公司）；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機（上海迪圖生物科技有限公司）；EL602型電子分析天平（蘇州市萊頓科學儀器有限公司）；臺式凍干機（北京華誼偉業(yè)科技有限公司）；KDN-04型消化爐（上海新嘉電子有限公司）；DFT-100型手提式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；S21-Ni4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金城國晟儀器實驗廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牡丹籽粕蛋白等電點的測定[6]

稱取適量脫脂牡丹種子粉置于250 mL燒杯中，按1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 10，放入超聲清洗器中，于50 ℃超聲恒溫反應100 min，離心（4 800 r/min，15 min），得到上清液。分取上清液6份各15 mL，用0.5 mol/L鹽酸分別調(diào)節(jié)至pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5，在轉(zhuǎn)速4 800 r/min下離心15 min，將上清液去除，將沉淀干燥后稱其質(zhì)量，將沉淀量（干燥后的沉淀質(zhì)量/原料質(zhì)量）與pH對應關系作圖，沉淀量最高時的pH即為牡丹籽粕蛋白等電點。

1.3.2 牡丹籽粕蛋白制備工藝[7]

牡丹籽粕粉→加蒸餾水→調(diào)節(jié)pH至堿性→在固定功率200 W下超聲堿提→4 800 r/min離心15 min→ 上清液調(diào)pH至等電點→4 800 r/min離心15 min→沉淀加水溶解→調(diào)pH→加糖化酶酶解→滅酶→調(diào)pH至中性→離心→沉淀洗滌→凍干→牡丹籽粕粗蛋白

蛋白質(zhì)得率=提取得到蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料質(zhì)量×100% （1）

1.3.3 牡丹籽粕蛋白提取工藝單因素試驗

以料液比、超聲溫度、超聲時間和酶添加量為影響因素，采用超聲輔助酶法提取，研究各單因素對牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率的影響。料液比為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14（g/mL）；超聲處理時間為60，80，100，120和140 min；超聲溫度分別為45，50，55，60和65 ℃；糖化酶劑量分別為1%，2%，3%，4%和5%。

1.3.4 牡丹籽粕蛋白提取工藝響應面試驗

基于單因素試驗基礎，以超聲溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、糖化酶劑量（D）為自變量，牡丹籽粕蛋白得率為響應值（Y），使用Design-Expert V8.0.6軟件，進行四因素三水平響應面分析，建立牡丹籽粕蛋白得率的二次多項式數(shù)學模型。試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.3.5 牡丹籽粕蛋白功能性質(zhì)評價

1.3.5.1 持水性[8]

稱取0.5 g牡丹籽粕蛋白質(zhì)（m0）置于干燥離心管中，稱量蛋白質(zhì)和離心管的質(zhì)量（m1），加10 mL去離子水，攪拌均勻后在60 ℃下水浴加熱30 min，冷卻至室溫，離心（4 800 r/min，10 min），棄上清液，擦干離心管內(nèi)外壁的水分后稱其質(zhì)量（m2），樣品的持水性（g/g）按式（2）計算。

1.3.5.2 吸油性[9]

稱取0.5 g牡丹籽粕蛋白，置于離心管中，加入5.0 mL大豆油，混勻后在室溫下靜置0.5 h，離心（4 800 r/min，15 min），記下游離油的體積。樣品的吸油性（mL/g）按式（3）計算。

1.3.5.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性[10]

稱取1 g牡丹籽粕蛋白質(zhì)，加入蒸餾水25 mL攪拌分散，加入大豆油5 mL，以2 000 r/min均勻攪拌，以3 000 r/min離心5 min，樣品的乳化性按式（4）計算。

1.3.5.4 起泡性與起泡穩(wěn)定性[11]

稱取1 g牡丹籽蛋白，溶于50 mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至中性，攪拌10 min，定容為100 mL測試溶液，以1 000 r/min攪拌3 min，記錄上層泡沫體積（V1）。靜置30 min后，再次記錄上層的泡沫體積（V2）[11]。樣品的起泡性和起泡穩(wěn)定性按式（6）和（7）計算。

2 結果與分析

2.1 牡丹籽粕蛋白等電點分析

圖1 不同pH下的沉淀量

蛋白質(zhì)在等電點時，蛋白質(zhì)分子呈電中性，分子間凝聚從而析出沉淀，因此可根據(jù)沉淀量的大小判斷牡丹籽蛋白質(zhì)等電點[12]。牡丹籽粕蛋白沉淀量隨著pH增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，pH 4.0時，沉淀量最大，此時接近蛋白質(zhì)等電點。

2.2 單因素條件對牡丹籽粕蛋白得率的影響

2.2.1 料液比對牡丹籽粕蛋白得率的影響

由圖2可見，料液比1∶6～1∶14（g/mL）時，隨著液體占比的增加，牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率先增加后下降，這可能是因為液體占比增大，牡丹籽粕粉與溶劑的接觸面積增加，蛋白質(zhì)的分散效率提高，所以蛋白得率增加[13]。但過大的液體占比反而使蛋白質(zhì)提取率降低，可能是因為在濃度過低的分散體系中易導致處理時溶質(zhì)丟失，還會造成后續(xù)成本和水的耗量過多。因而，選擇料液比1∶10（g/mL）為最佳。

圖2 料液比對蛋白質(zhì)得率的影響

2.2.2 超聲時間對牡丹籽粕蛋白得率的影響

由圖3可見，超聲提取時間60～120 min時，隨著超聲時間的增加，牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率增加，這是因為超聲波的機械與空化作用的影響，會增加堿液對原料細胞的滲透，適當延長超聲時間，能使牡丹籽粕中的蛋白質(zhì)盡可能溶解在溶劑中[14]，超聲提取時間超過120 min時，蛋白質(zhì)產(chǎn)量開始隨時間下降，可能是因為提取時間過長導致蛋白質(zhì)凝聚沉淀，在后續(xù)離心過程中與沉淀一起除去，上清液中蛋白質(zhì)含量降低，得率減小。因此選擇超聲時間120 min為最佳。

圖3 超聲時間對蛋白質(zhì)得率的影響

2.2.3 超聲溫度對蛋白得率的影響

由圖4可見，超聲溫度升高時，蛋白質(zhì)得率先升高后降低，這可能是溫度的升高使得蛋白質(zhì)溶解度增大，溶解在堿液中的蛋白質(zhì)增加，50 ℃時得率最高，溫度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)會發(fā)生熱變性，部分溶解的蛋白質(zhì)會發(fā)生交聯(lián)聚合，蛋白質(zhì)的溶解度降低使得蛋白質(zhì)得率降低。因此，超聲提取適宜的溫度條件為50 ℃。

圖4 超聲溫度對蛋白質(zhì)得率的影響

2.2.4 糖化酶劑量對牡丹種子粉蛋白得率的影響

隨著糖化酶劑量的增加，牡丹籽粕蛋白得率呈上升趨勢，可能是糖化酶水解牡丹籽粕中的淀粉，加速了蛋白質(zhì)的溶出。糖化酶劑量2%時蛋白得率最高，繼續(xù)增加糖化酶劑量，蛋白質(zhì)得率變化不大，糖化酶的作用達到飽和，因而選擇糖化酶最優(yōu)用量為2%。

圖5 糖化酶劑量對蛋白質(zhì)得率的影響

2.3 響應面優(yōu)化試驗設計分析

2.3.1 牡丹籽粕蛋白提取結果

為進一步優(yōu)化牡丹籽粕蛋白提取工藝，根據(jù)前期單因素試驗結果，以超聲時間、超聲溫度、料液比、糖化酶劑量為自變量，牡丹籽粕蛋白得率為響應值，響應面試驗設計和結果見表2。

2.3.2 響應面試驗回歸模型的建立

采用Design-Expert V8.0.6b軟件對表2的試驗結果進行回歸分析，得到回歸模型：蛋白質(zhì)得率Y=25.70+0.75A+0.94B+0.42C+0.48D-0.77AB-0.20AC+0.46AD-1.63BC-0.66BD-2.06CD-2.05A2-2.71B2-2.16C2-4.08D2。對回歸模型的方差分析結果如表3所示。

表2 響應面法試驗設計及結果

由表3可知：該模型F=10.91，P＜0.000 1，表明牡丹籽粕蛋白提取效果回歸模型極顯著；回歸方程失擬值為0.17（P=0.601 8＞0.05），表明失擬項與純誤差相關不顯著；決定系數(shù)R2=0.916 0，C.V.=5.42%。因此，模型的擬合程度較好，置信度高，使用該方程可對牡丹籽粕蛋白得率進行預測與分析。

表3 牡丹籽粕蛋白得率試驗方差分析結果

模型自變量的一次項A、B對蛋白質(zhì)得率影響呈顯著水平（P＜0.05）；超聲溫度和料液比交互項顯著，料液比和糖化酶劑量交互性極顯著，其他交互因素不顯著；在二次項中A2、B2、C2、D2效果極顯著，說明各影響因素對蛋白質(zhì)得率的影響不是簡單線性關系；由F值大小可以看出，牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率的影響因素大小順序為B＞A＞D＞C，即超聲溫度＞超聲時間＞糖化酶劑量＞料液比。

2.3.3 響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，得到影響牡丹籽粕蛋白質(zhì)提取因素的響應面圖和等高線圖（圖6）。響應面曲線圖可以直觀反映2個因素交互作用對牡丹籽粕蛋白得率影響的顯著程度。響應曲面形狀越陡峭，對蛋白質(zhì)得率影響越大。等高線的形狀反映因素交互作用的強弱，如果等高線輪廓形狀趨向于橢圓形，則交互作用明顯，如果輪廓形狀趨向于圓形，則交互作用不明顯。

圖6表明，糖化酶添加量和料液比在圖上表現(xiàn)為曲面陡峭，對牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率影響較顯著。糖化酶添加量與料液比、超聲溫度與料液比的相互作用明顯，等高線輪廓線呈橢圓形。

圖6 各交互因素對牡丹籽粕蛋白得率影響的響應面圖和等高線圖

2.3.4 模型的驗證性試驗

通過軟件分析得出，超聲溫度50.71 ℃、超聲時間119.75 min、料液比1∶9.98（g/mL）、糖化酶劑量2.01%是牡丹籽粕蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件。在此條件下，牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率的預測值可達25.845%。根據(jù)實際操作情況，將牡丹籽粕蛋白質(zhì)提取的最佳條件修正為糖化酶劑量2%、提取溫度50 ℃、料液比1∶10（g/mL）、提取時間120 min。試驗后測得蛋白質(zhì)得率為26.65%，與預測結果的偏差為0.805%，模型的有效性得到驗證。測得該工藝條件下提取的蛋白質(zhì)含量為91.02%，純度較高。

2.4 牡丹種子蛋白功能性質(zhì)

大豆分離蛋白以其良好的功能特性，可作為食品添加劑被廣泛應用于食品加工中，如肉制品、焙烤食品、乳制品生產(chǎn)等。將提取的牡丹籽粕蛋白的功能特性與大豆分離蛋白進行比較，結果如表4所示。

蛋白質(zhì)的持水性是指蛋白質(zhì)在一定條件下受熱后保持水分的能力，吸水性有助于減少水分流失，從而起到改善食品口感和質(zhì)地的作用。蛋白質(zhì)籽粕蛋白的持水能力比大豆蛋白高（見表4），可能是超聲提取牡丹籽粕蛋白時，超聲波的作用使得蛋白質(zhì)充分由大分子變成小分子，更多蛋白質(zhì)分子親水基團暴露在表面，與水分子之間的作用力增加，提高了蛋白質(zhì)的持水性[5]。吸油性是指吸附油脂并截留油于組織內(nèi)部的能力，牡丹籽粕蛋白的吸油性略低于大豆分離蛋白，與油脂等疏水性物質(zhì)的相互作用較小，不適合應用在油脂類食品生產(chǎn)中。乳化性是指蛋白質(zhì)與水、油作用后形成乳濁液的能力，乳化性能好的蛋白質(zhì)更適合應用在油脂類食品生產(chǎn)中[15]。牡丹籽粕蛋白質(zhì)的乳化性略低于大豆分離蛋白，乳化穩(wěn)定性強于大豆分離蛋白，將其作為乳化劑應用具有一定優(yōu)勢[16]。蛋白質(zhì)良好的發(fā)泡性會賦予食物良好的口感及松軟的組織結構，通常應用在焙烤食品加工中。牡丹籽粕蛋白起泡性不如大豆分離蛋白，但是泡沫穩(wěn)定性較好。

表4 牡丹籽粕蛋白與大豆分離蛋白功能性質(zhì)比較

3 結論

利用超聲波輔助糖化酶法提取牡丹籽粕蛋白，在單因素試驗基礎上，采用響應面優(yōu)化法優(yōu)化蛋白質(zhì)提取工藝條件，并研究在此條件下制備的牡丹籽粕蛋白功能性質(zhì)。結果發(fā)現(xiàn)：牡丹籽粕蛋白提取的工藝最優(yōu)條件為料液比1∶10（g/mL）、糖化酶劑量2%、超聲溫度50 ℃、超聲時間120 min。此條件下牡丹籽粕蛋白質(zhì)得率為26.65%，牡丹籽粕蛋白中的蛋白質(zhì)含量為91.02%。對蛋白質(zhì)得率產(chǎn)生影響的因素主次順序為超聲溫度＞超聲時間＞糖化酶劑量＞料液比。試驗結果為牡丹籽粕蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。牡丹籽粕蛋白的持水性、泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性均比大豆分離蛋白好，但吸油性、乳化性和起泡性弱于大豆蛋白。