搜風祛痰中藥對動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠IL-1β及IL-18的影響*

張 磊 宮麗鴻 趙 兵 李思琦 肖福龍

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)指由于脂質(zhì)代謝障礙，在動脈及其分支血管壁內(nèi)膜發(fā)生脂質(zhì)沉積，最后成為粥樣病灶的慢性炎癥性疾病[1]。近年來，大批研究證明，AS并不是簡單的脂質(zhì)被動浸潤，而是一個主動的有免疫學程序參與其中的炎癥性過程[2]。由于動脈血管內(nèi)皮損傷，脂質(zhì)大量沉積，活化內(nèi)皮細胞，從而誘發(fā)炎癥反應，釋放炎癥因子，進而導致斑塊形成[3]。隨著時間的推移，斑塊中的各種免疫細胞會進一步引起局部的炎癥反應及斑塊的形成，而炎癥反應的逐步加重不利于斑塊穩(wěn)定，這也會導致斑塊破裂以及血栓的成型，最后會造成心血管病變的出現(xiàn)[4,5]。整體而言，炎癥反應對AS的發(fā)病會產(chǎn)生極大的影響，并貫穿AS的整個過程。在AS斑塊產(chǎn)生、進展與破裂場景中存在炎性因子的介導。而IL-1β與IL-18是參與炎癥反應的重要炎癥因子[6,7]。所以，AS早期依靠抑制IL-1β與IL-18的釋放機制，能夠較為高效地干預AS的進展，進一步降低斑塊問題的出現(xiàn)。動物實驗已得出中藥的治療方法對于抗AS與穩(wěn)定斑塊等取得了較為理想的效果[8,9]，所以本研究將基于現(xiàn)有的研究成果，綜合觀察所選中藥對小鼠IL-1β及IL-18表達水平所產(chǎn)生的影響，進一步探討其治療AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇60只6周雄ApoE小鼠，采購自北京華阜康，其具體的批號是：SCXK (京) 2020-0004。同時選定總數(shù)量為20只C57BL/6J小鼠，采購自遼寧長生，其具體的批號數(shù)據(jù)則是：SCXK (遼) 2020-0001。本次研究工作經(jīng)過了院內(nèi)倫理委員會的審核，具體的編號為：21000042020038。

1.2 實驗藥品搜風祛痰中藥:全蝎5 g，蜈蚣1條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g，加工成含生藥2 g/ml濃縮液待用，購于遼寧中醫(yī)中草藥局；阿托伐他汀鈣片:10 mg/片(該產(chǎn)品采購于輝瑞，其具體的批號數(shù)據(jù)是：EG6187)。

1.3 實驗試劑及儀器蘇木素伊紅(該產(chǎn)品采購于索萊寶科，其具體的批號數(shù)據(jù)是：G1120)；辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG；離心機，F(xiàn)C酶標儀；脫水、包埋、切片機；CHA型光學顯微鏡。

1.4 構(gòu)建 AS 模型對于實際數(shù)量為60只的ApoE小鼠，進行持續(xù)1周的普食，后續(xù)則是調(diào)整成高脂飼料，采購于盛旺牧業(yè)。高脂喂養(yǎng)13周之后，運用隨機法選定4只進行處死處理，取腹主動脈血管，后續(xù)依靠HE染色程序，確認造模程序是否順利完成[10]。

1.5 分組與處理隨機選定50只順利完成造模的ApoE小鼠，隨機分為模型組，中藥低、中、高劑量組和西藥組，每組實際數(shù)量為10只，提供相應的高脂飼喂?？瞻讓φ战M選定10只C57BL/6J小鼠，提供一般飼料開展喂養(yǎng)。并依據(jù)臨床上成人每日口服藥物用量，以及小鼠與人的口服藥物等效用量換算公式[11]，計算得出各組小鼠每日所需的灌胃量。各組小鼠共進行為期13周的灌胃，每日1次。對于對照與模型組，采用0.3 ml/d生理鹽水開展相應灌胃處理；對于西藥組則是采用具體劑量為25.4 mg/(kg·d)的阿托伐他汀鈣片，予以灌胃處理；對于中藥低、中、高劑量組則分別采用具體劑量為 6.175 g/(kg·d)、12.35 g/(kg·d)、24.7 g/(kg·d)的搜風祛痰中藥進行灌胃給藥。實驗完成時，從各組小鼠眼球處取出血液樣本置于抗凝管中，而且基于4 ℃環(huán)境之中，將有著血液樣本的相關(guān)抗凝管放入到離心設備內(nèi)，設定具體參數(shù)為3000 r/min處理15 min，最后分離所需血清并做除菌處理，存放于EP管中一并存放于-80 ℃冰箱中備用。后續(xù)對于小鼠開展脫頸處死，處死后立即解剖小鼠并提取小鼠的心臟和腹主動脈，并用10%甲醛溶液將其固定。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 HE染色觀察斑塊面積處死小鼠提取腹主動脈，應用4%多聚甲醛，將腹主動脈持續(xù)處理24 h，石蠟包埋。樣本應用切片機進行處理，處理為5 μm切片，后續(xù)應用蘇木精與伊紅進行染色處理之后，放入到顯微鏡中開展觀察工作。

1.6.2 Western Blot檢測細胞IL-1β和IL-18蛋白表達水平實驗完成時收集所需組織細胞，按照細胞樣本量以1∶10的比例加入細胞裂解液裂解樣本細胞，然后加入蛋白提取劑以提取樣本蛋白，樣本勻漿后于冰上靜置20 min，離心后將上清液置于EP管中待用。運用Brad-ford法測試具體的蛋白濃度數(shù)據(jù)，將各組蛋白濃度數(shù)據(jù)調(diào)控一致。對于各個孔上樣同等劑量的樣品，后續(xù)應用SDS-聚丙稀酰胺凝膠開展針對性的電泳處理，電泳完成后獲得的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，增添一抗之后放入到4 ℃環(huán)境過夜，再加入二抗置于室溫下孵育1 h，ECL顯影之后，使用感光膠片進行曝光處理，依靠圖像系統(tǒng)開展掃描操作，測定獲得目的與內(nèi)參蛋白之間的具體灰度參數(shù)，而且計算兩者之間的比值，以此值作為所測樣本蛋白的表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠HE染色比較對照組：未見斑塊，內(nèi)膜保持光滑與完整狀態(tài)。模型組：管壁破損，存在大量泡沫的細胞，內(nèi)膜有一定的增長，形成斑塊。中藥低、中、高劑量組和西藥組：內(nèi)膜都會有一定的斑塊，但是均顯著少于模型組，且中藥中劑量組面積最小。見圖1。

圖1 各組斑塊面積(HE染色，×100 倍)

2.2 各組細胞IL-1β和IL-18蛋白表達比較與對照組數(shù)據(jù)進行對比，模型組IL-18、IL-1β指標升高(P<0.05)。見表1。與模型組數(shù)據(jù)進行對比，中藥各劑量組和他汀組IL-18、IL-1β指標均降低(P<0.05)。各組細胞IL-1β和IL-18蛋白電泳圖見圖2。

表1 各組小鼠IL-18 IL-1β蛋白表達水平比較 (例，

注：1：對照；2：模型；3：中藥低劑量；4：中劑量；5：高劑量；6：西藥。圖2 各組細胞IL-1β和IL-18蛋白電泳圖

3 討論

AS是冠心病的主要發(fā)病因素，對人民身體健康和生活質(zhì)量都帶來了很大的負面影響[12]。雖然中醫(yī)學中并沒有AS這個病名，但通過對AS臨床表現(xiàn)的觀察和總結(jié)可將其歸屬于中醫(yī)“胸痹”范疇中。AS患者多為老年患者，平素喜食膏粱厚味，日久脾胃虛弱，運化失常，津液失于疏布而生痰濁，痰濁為無形實邪，容易導致人體氣機的阻滯，造成氣血運行受阻，體內(nèi)出現(xiàn)瘀血，導致痹阻心脈問題的出現(xiàn)。痰濁和瘀血之間又可相互作用，痰瘀互結(jié)可痹阻陽氣化生毒熱，熱極生風，風痰內(nèi)動，這些機制會導致AS等病變，故宮麗鴻教授根據(jù)經(jīng)驗總結(jié)創(chuàng)新，創(chuàng)新性提出“風痰”是AS的主要致病因素[13,14]，并創(chuàng)新性化裁《醫(yī)學衷中參西錄》中逐風湯，創(chuàng)搜風祛痰中藥治療以AS為基礎的心血管疾病，取得顯著療效。方中蜈蚣、全蝎、地龍三藥共用，兼具搜風止痙、通絡止痛的治療效果，共為君藥；陳皮、法半夏、白術(shù)，兼具化濕健脾，理氣化痰的治療效果，在整個方劑之中作為臣藥；水蛭有著破瘀通經(jīng)的治療效果，在方劑之中作為佐藥，整方可以實現(xiàn)搜風祛痰、通絡止痛之效。

炎癥反應對于AS會產(chǎn)生顯著的影響，血脂異常是其基礎，二者相輔相成，共同構(gòu)成了AS的基本發(fā)病機制。同時近期研究表明，膽固醇對于炎癥反應會產(chǎn)生顯著的影響，遭遇細胞吞噬之后能夠激活NLRP3小體，從而促進IL-1β、IL-18的成熟及分泌[15-17]，且IL-1β又可引起其下游的IL-18的激活，再度促進炎癥反應的發(fā)生[18]。IL-1β、IL-18均是參與AS早期發(fā)病的重要炎癥因子，且其表達水平與斑塊及疾病嚴重程度成正比，故抑制IL-1β、IL-18的表達可以抑制AS的形成和發(fā)展，減少心血管事件的發(fā)生。

阿托伐他汀屬他汀類藥品，其對降脂、穩(wěn)定斑塊的效果已被普遍認可，同時阿托伐他汀具備抗炎癥功能[19]，可抑制IL-1β及IL-18等炎癥因子的表達，而且具備改善內(nèi)皮功能與抑血栓等積極效應[20]。因該藥能夠抑制炎癥因子的表達，對于心血管病癥有很大的價值，因此本次實驗中最終決定采用阿托伐他汀充當對照組。

本研究結(jié)果表明，小鼠腹主動脈切片經(jīng)HE染色觀察對比，對照組未出現(xiàn)明顯的斑塊，模型組的斑塊相對偏多，中藥各組、西藥組斑塊都較模型組顯著降低；通過斑塊面積檢測，意味著中西藥療法對AS都可以實現(xiàn)較為理想的療效。和空白對照組數(shù)據(jù)相比，各組IL-1β、IL-18指標均升高，意味著正常情況下，兩大因子為正常狀態(tài)，所以對照組的2項指標都相對偏低。但血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷問題后，大量脂質(zhì)堆積，IL-1β、IL-18被激活釋放，故模型組2指標均增高。搜風祛痰中藥以及阿托伐他汀均有助于減少IL-1β、IL-18的生成，故二者表達水平降低。

綜合前文分析可得出，搜風祛痰的治療方案，能夠較為高效地抑制炎癥反應，使得IL-1β、IL-18的指標下調(diào)，縮小斑塊面積，這或許是其對動脈粥樣硬化的治療機制之一。