茯苓多糖對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Nrf2ARE信號(hào)通路的影響

梁靜 陳漢仁 毛敏蕓 蔣靜子 彭天嬋

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，影響全球超過7 000萬人，給患者、護(hù)理人員和社會(huì)帶來巨大的身體、心理、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。盡管癲癇研究取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但約35%的癲癇患者對(duì)抗癲癇藥有抗藥性，并長(zhǎng)期經(jīng)歷反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作[2]。據(jù)報(bào)道，癲癇持續(xù)狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能障礙并導(dǎo)致能量衰竭，進(jìn)而加劇氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度，并導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷或死亡[3]。因此，從抑制氧化應(yīng)激，降低海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的角度開發(fā)新的藥物，對(duì)于癲癇的治療具有重要的意義。茯苓多糖 (polysaccharides of poria cocos，PPC)來源于真菌茯苓的菌核,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物活性[4]。有研究顯示，PPC可抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的帕金森小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用[5]。本研究主要探討PPC對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響以及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD大鼠購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2020-0055，大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則，本研究得到醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 茯苓購自廣印堂中藥股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔源一抗活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bax、核因子E2相關(guān)因子2 (Nrf2)、血紅素氧化酶 (HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)、β-actin及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自天馳生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物有限公司。

1.3 PPC的制備 參照文獻(xiàn)[6]，用95%乙醇脫脂，水提醇沉法提取，沉淀出的多糖經(jīng)Sevag法除蛋白后透析，冷凍干燥，即可得到粗多糖提取物。

1.4 癲癇大鼠模型的構(gòu)建及動(dòng)物分組 隨機(jī)選取48只大鼠構(gòu)建癲癇大鼠模型，剩余12只作為NC組。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行癲癇模型構(gòu)建：將大鼠按照127 mg/kg的劑量腹腔注射氯化鋰，20 h后按照1 mg/kg的劑量皮下注射東莨菪堿，30 min后按照50 mg/kg的劑量腹腔注射毛果蕓香堿。NC組大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。通過Racine分級(jí)[8]判定癲癇發(fā)作級(jí)別，4級(jí)持續(xù)>30 min進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)則認(rèn)為造模成功。造模成功后，將癲癇大鼠模型隨機(jī)分為Model組、茯苓多糖低劑量組(PPC-L組)、茯苓多糖中劑量組(PPC-M組)、茯苓多糖高劑量組(PPC-H組)，每組12只。參考文獻(xiàn)[9,10]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠分別按照50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg的劑量灌胃PPC，1次/d，連續(xù)14 d。NC組和Model組灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 大鼠癲癇發(fā)作潛伏期測(cè)定 觀察并記錄5組大鼠末次給藥12 h至首次出現(xiàn)>4級(jí)癲癇的發(fā)作時(shí)間。

1.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7](1)學(xué)習(xí)能力：將大鼠放到任意一入水點(diǎn)，將其游到平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期，如果在120 s內(nèi)不能游到平臺(tái)，就引導(dǎo)其爬到平臺(tái)，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄第6天的逃避潛伏期。(2)空間記憶能力：第7天撤去平臺(tái)，以距平臺(tái)最遠(yuǎn)的地方為入水點(diǎn)，觀察并記錄大鼠120 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT、GSH水平的測(cè)定 嚴(yán)格按照SOD、CAT、GSH試劑盒說明書操作步驟測(cè)定大鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH水平。

1.8 TUNEL染色檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 將海馬組織切片脫蠟至水，加入3%H2O2及蛋白酶K孵育30 min后，再加入 50 μl TUNEL反應(yīng)混合物，在37℃下孵育60 min。最后加入 DAPI 染色10 min，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=(染色陽性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解緩沖液裂解并提取大鼠海馬組織中的總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，添加一抗Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1、β-actin，均為1∶2 000稀釋，在4℃下孵育過夜，然后與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h后，通過Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 PPC對(duì)大鼠癲癇發(fā)作潛伏期的影響 NC組大鼠沒有癲癇發(fā)作的跡象，與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期比較

2.2 PPC對(duì)大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響 與NC組比較，Model組逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.3 PPC對(duì)大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與NC組比較，Model組CAT、SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組CAT、SOD、GSH水平明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT、GSH水平比較

2.4 PPC對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，Model組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表4。

NC組 Model組 PPC-L組 PPC-M組 PPC-H組

表4 5組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

2.5 PPC對(duì)5組大鼠海馬組織中凋亡蛋白及(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件 (antioxidant response element，ARE) 通路蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，Model組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠海馬組織中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 western blot檢測(cè)Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)；A NC組；B Model組；C PPC-L組；D PPC-M組；E PPC-H組

表5 5組大鼠海馬組織中Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)比較

3 討論

癲癇的主要特征是反復(fù)發(fā)作和一系列神經(jīng)行為合并癥，包括認(rèn)知障礙和社會(huì)適應(yīng)行為異常[11]。研究表明，氧化應(yīng)激與癲癇的進(jìn)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12]。海馬組織是對(duì)學(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要的大腦區(qū)域，其神經(jīng)元損傷可引起認(rèn)知功能障礙[13]。癲癇發(fā)作后，可引起海馬組織神經(jīng)元損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠存在癲癇行為，逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，說明癲癇大鼠模型存在認(rèn)知功能障礙。SOD、CAT、GSH均為抗氧化酶，在機(jī)體中具有清除自由基的作用，其水平高則表明氧化應(yīng)激受到抑制[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，Model組大鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH水平顯著降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)顯著升高，提示在癲癇大鼠模型中氧化應(yīng)激增強(qiáng)，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡升高。

近年來，關(guān)于PPC在改善機(jī)體氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡方面的研究越來越多。如PPC提取物對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激和炎癥損傷有關(guān)[16]；PPC能增強(qiáng)腎臟抗氧化性,保護(hù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷，可以治療或延緩糖尿病腎病的發(fā)生[17]；PPC對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)肝臟抗氧化能力及減輕炎癥有關(guān)[18]；PPC能抑制2型糖尿病小鼠腎組織中Bax基因過多表達(dá)，使糖尿病狀態(tài)下腎組織細(xì)胞凋亡趨勢(shì)受到抑制[19]。但關(guān)于PPC對(duì)癲癇大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響筆者尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，與Model組比較，PPC低、中、高劑量組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，海馬組織中SOD、CAT、GSH水平顯著升高，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示PPC可能通過提高抗氧化酶活性抑制氧化應(yīng)激，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)癲癇大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

Nrf2 是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)劑，其可與ARE結(jié)合形成Nrf2-ARE復(fù)合體，激活HO-1、NQO-1等具有抗氧化能力的酶[20]。相關(guān)研究報(bào)道，辛伐他汀通過激活Nrf2/ARE通路增強(qiáng)Nrf2和HO-1表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用、抑制細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用[21]；白藜蘆醇通過其抗氧化作用抑制了草酸鈣晶體對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷及黏附，此作用可能與激活Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，Model組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示Nrf2/ARE信號(hào)通路可能參與了癲癇大鼠的氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程；與Model組比較，PPC低、中、高劑量組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，且呈劑量依賴性，提示PPC可能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癲癇作用。

綜上所述，PPC可抑制氧化應(yīng)激，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癲癇作用，該機(jī)制可能與激活Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。