網絡藥理學結合巨噬細胞實驗分析薏苡仁抗炎機制

劉杰 劉振強 包蕾

炎性反應是機體內一種重要且復雜的生物過程，它可以保護機體免受感染、損傷或損傷造成的潛在傷害。有效的炎性反應依賴于免疫系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和組織之間細胞和分子復雜的相互作用[1]。但是當細胞和分子之間的穩(wěn)態(tài)被打破，會引發(fā)過度的炎性反應，最終導致免疫介導的炎癥性疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、牙周炎、血管炎等多種疾病[2-4]。持續(xù)的慢性低水平炎性反應還會導致冠心病、代謝綜合征、糖尿病腎病[5,6]，甚至炎癥也越來越多地被認為是導致癌癥和精神疾病的誘因[7]。因此，有效的降低過度炎性反應至關重要。薏苡仁為禾本科植物薏苡 Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen (Roman.) Stapf 的干燥成熟種仁。性甘、淡、涼，歸脾、胃、肺經。化學成分包括脂肪油、薏苡仁酯、薏苡仁內酯、薏苡仁多糖等。主要應用于水腫、腳氣浮腫、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、贅疣等多種疾病[8]。目前，臨床上關于薏苡仁治療風濕病、皮膚病和腎病等炎癥相關的疾病有很多報道，療效顯著[9]。但是關于薏苡仁抗炎的主要成分、相關靶點及主要作用機制仍不明確。因此本研究利用網絡藥理學[10]探究薏苡仁抗炎的主要活性成分、關鍵靶點及重要通路，并結合體外脂多糖(LPS)誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥模型實驗驗證其主要活性成分對炎性因子TNF-α和INF-γ的影響，為薏苡仁應用于炎癥相關疾病的治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠RAW264.7巨噬細胞購于美國菌種保藏中心。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，胎牛血清購于美國Clark Bioscience公司，LPS、β-谷甾醇標準品、四甲基偶氮唑藍MTT購于美國Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶科技有限公司，TNF-α、IFN-γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(小鼠)購于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 儀器設備 酶聯(lián)免疫檢測儀購于瑞士Tecan公司，CO2培養(yǎng)箱、臺式高速離心機購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，倒置顯微鏡購于德國徠卡公司，高壓蒸汽滅菌鍋購于上海申安醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 薏苡仁活性成分篩選及靶點預測：利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)平臺[11]獲得薏苡仁的化學成分，選擇OB≥30%且DL≥0.18的成分作為候選活性成分，并獲得候選活性成分的mol2格式結構圖，上傳至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)服務器，獲取前300個靶點。將靶點蛋白導入UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫，獲取靶點蛋白對應基因名。

1.4.2 免疫疾病相關靶點預測：在OMIM(https://www.omim.org/)數據庫、GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫、DRUGBANK(https://www.drugbank.ca/)數據庫中獲取抗炎相關靶點。

1.4.3 獲取交集基因：通過Venny 2.1.0在線分析工具獲取潛在作用靶點。

1.4.4 薏苡仁-化學成分-潛在作用靶點網絡構建：將“1.4.3”中獲取的潛在作用靶點利用 Cytoscape 3.7.1軟件構建“薏苡仁-活性成分-潛在靶點”相互作用網絡。

1.4.5 關鍵靶點的互作：將“1.4.3”中潛在作用靶點導入String(https://string-db.org/)數據庫，Organism設定為“Homo sapiens”，“highest confidence”≥0.9，根據Degree值排序，獲得Degree值前十的靶點。

1.4.6 薏苡仁抗炎功能GO分析：通過DAVID(https//david.ncifcrf.gov/)數據庫對薏苡仁抗炎功能的潛在作用靶點進行GO富集分析，限定“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，選取P<0.05的條目來評估生物過程(biological process，BP)，細胞組分(cellular component，CC)和分子功能( molecular function，MF)三個模塊，并根據基因數排序，分別選取三個模塊的前10條富集結果，導入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺進行可視化分析。

1.4.7 薏苡仁增強免疫功能代謝通路富集分析：應用DAVID平臺對潛在作用靶點進行KEGG代謝通路富集分析，限定“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，根據富集分析的結果明確潛在作用靶點參與的代謝通路，進而明確該藥治療某種疾病的主要代謝通路，限定P<0.05，根據通路中所含的基因數進行排序，選取前15條通路導入微生信平臺進行可視化分析。

1.5 實驗驗證 藥物配制：將β-谷甾醇溶于DMSO后，用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)配制成200 μmol/L的β-谷甾醇母液，0.22 μm濾膜過濾除菌后，用完全培養(yǎng)基稀釋成20、2、0.2、0.02、0.002 μmol/L的溶液。

1.5.1 細胞炎癥模型：采用LPS(100 ng/ml)誘導RAW264.7細胞。取適當稀釋的對數生長期細胞2 ml，加入6孔板，于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。吸出孔內培養(yǎng)液，模型組加入2 ml完全培養(yǎng)基配制的100 ng/ml LPS溶液，LPS終濃度100 ng/ml；給藥組加入1 mL不同濃度的β-谷甾醇溶液和1 ml完全培養(yǎng)基配制的200 ng/ml LPS溶液，β-谷甾醇溶液終濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L，LPS終濃度100 ng/ml；空白組為與給藥組含相同量DMSO的完全培養(yǎng)基。重復3個孔，培養(yǎng)24 h后，收集上清，12 000 r/min離心，取上清液用于炎性因子的檢測。

1.5.2 炎性因子檢測：采用ELISA法檢測RAW264.7細胞TNF-α和INF-γ的濃度，具體檢測步驟參照說明書。450 nm下測定OD值，分別根據標準品濃度及各孔OD值繪制標準曲線回歸方程，R2>0.99可用于下一步。將樣本所測得OD值帶入方程，計算待測樣本中TNF-α和INF-γ的濃度。

2 結果

2.1 活性成分篩選及靶點預測 TCMSP數據庫獲得薏苡仁化學成分38個，其中OB≥30%且DL≥0.18的10個有效活性成分，其中薏苡仁內酯未找到其分子式，因此舍棄。最終獲得9個有效活性成分，352個靶點。見表1。

表1 薏苡仁化學成分

2.2 免疫疾病相關靶點的篩選和預測 在DRUGBANK、TTD、OMIM數據庫輸入關鍵詞“Inflammation”，分別獲得相關靶點290、158、1 083個，去除重復項后共獲得靶點840個。

2.3 獲取交集基因 通過Venny 2.1.0在線分析工具對352個活性成分靶點和840個疾病靶點進行對比分析，獲得50個潛在作用靶點。

2.4 薏苡仁-活性成分-潛在作用靶點網絡構建 將活性成分及其對應潛在作用靶點信息導入Cytoscape 3.7.1軟件構建“薏苡仁-活性成分-潛在靶點”相互作用網絡。共60個節(jié)點，其中藥材節(jié)點1個，活性成分節(jié)點9個，潛在靶點節(jié)點50個，共計365條連線。見圖1。

圖1 薏苡仁-活性成分-潛在靶點相互作用網絡圖;薏苡仁； 9個活性成分； 50個潛在靶點

2.5 薏苡仁抗炎潛在靶點PPI網絡 將50個潛在作用靶點輸入String數據庫，構建相互作用網絡模型。篩選整理Degree值前10的靶點包括SRC、CASP3、MAPK1、PPARG等，說明這些靶點可能在薏苡仁抗炎中起到了關鍵作用。見圖2，表2。

表2 薏苡仁抗炎關鍵靶點

圖2 薏苡仁抗炎PPI網絡圖

2.6 GO富集分析 基于DAVID數據庫對潛在靶點進行GO分析，設定P<0.05，得到生物過程(BP，biological process)條目134個，細胞組分(CC，cellular component)條目18個，分子功能(MF，molecular function)條目55個，薏苡仁參與抗炎反應的生物學過程主要包括信號轉導(signal transduction)、蛋白水解(proteolysis)、炎性反應(inflammatory response)、凋亡過程(apoptotic process)等，參與抗炎反應的分子功能主要包括蛋白質結合(protein binding)、ATP結合(ATP binding)、鋅離子結合(zinc ion binding)、激酶活性(kinase activity)等。分別選取3個模塊的前10條富集結果，導入微生信平臺進行可視化分析。見圖3。

圖3 薏苡仁抗炎靶點GO分析

2.7 KEGG富集分析 通過DAVID數據庫對潛在作用靶點進行KEGG分析，限定P<0.05，根據通路中所包含的基因數進行排序，選取前15條通路導入微生信平臺進行可視化分析。薏苡仁抗炎的主要通路包括VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、癌癥中心碳代謝( Central carbon metabolism in cancer) 、花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等。見圖4。

圖4 薏苡仁抗炎靶點KEGG富集分析

2.8 β-谷甾醇抗炎效果驗證 LPS處理巨噬細胞組的INF-γ和TNF-α的表達量較高，分別為207.62和1 672.63 ng/L。與模型組相比，不同濃度β-谷甾醇(10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L)均有不同程度降低炎性因子的效果，且隨著濃度的升高抑制效果增加，在10 μmol/L時抑制作用最明顯，TNF-α和INF-γ的含量分別為1 022.35 ng/L、151.33 ng/L。見表3。

表3 炎性因子TNF-α和INF-γ濃度

3 討論

炎癥是免疫系統(tǒng)對有害刺激產生的一種應答反應，并通過消除有害刺激和啟動愈合過程來發(fā)揮作用[12]。適度的炎性反應可以有效地減少即將發(fā)生的損傷或感染，有利于恢復組織穩(wěn)態(tài)。然而，不受控制的急性炎性可能會轉變成慢性炎性，進而導致多種疾病的發(fā)生[13]。因此，抗炎是多種疾病防治的重要路徑。

巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的基本組成部分，是大多數組織中最豐富的免疫細胞，具有抗原呈遞，免疫監(jiān)視、調節(jié)、防御等多種功能[14]。此外，巨噬細胞在組織發(fā)育、維持組織穩(wěn)態(tài)、組織修復、組織再生和清除凋亡細胞等過程中也發(fā)揮著重要的作用[15]。當病原體入侵時，巨噬細胞被激活并通過釋放炎性因子來抵抗病原體，包括腫瘤壞死因子、白介素、干擾素等。然而，當這些炎性因子的產生得不到控制時，會對機體造成嚴重損傷，誘發(fā)多種疾病[16]。

Guo等[17]發(fā)現在體外實驗中薏苡仁可以促進雙歧桿菌和乳酸桿菌兩種益生菌的生長，在體內實驗中薏苡仁可以改善潰瘍性結腸炎大鼠的腸道菌群結構，緩解體內潰瘍性結腸炎的癥狀。Zhang等[18]研究表明薏苡仁可以改善類風濕性關節(jié)炎大鼠的癥狀，降低了促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1)的表達，并增加了抗氧化酶(GSH-Px、SOD 和 CAT)的活性。β-谷甾醇屬于植物甾醇類化合物，廣泛存在于天然植物中，被譽為“生命之鑰”。Liu等[19]研究表明β-谷甾醇可以調節(jié)巨噬細胞極化并減輕小鼠的類風濕炎性。Yin等[20]研究表明，β-谷甾醇及其衍生物通過抑制小鼠的氧化和炎性來抑制脂多糖/d-半乳糖胺誘導的急性肝損傷。張冬陽[21]從薏苡仁中提取的β-谷甾醇具有抑制有害菌，田丹丹等[22]從牛油果中提取植物甾醇，發(fā)現其同樣具有抑菌效果。

本研究查閱文獻發(fā)現其中β-谷甾醇[23]具有顯著的抗炎作用，β-谷甾醇可以顯著抑制巨噬細胞的炎性因子TNF-α和IFN-γ的表達，且這種抑制作用呈劑量依賴性。薏苡仁抗炎的主要靶點包括SRC、CASP3、MAPK1、PPARG、STAT1、NOS3、LCK、PPARA、NOS2、KIT等，這些靶點可能是薏苡仁發(fā)揮抗炎作用的重要靶點。SRC基因編碼的蛋白質是酪氨酸蛋白激酶，其可能在胚胎發(fā)育和細胞生長的調節(jié)中發(fā)揮作用，該基因的突變可能與結腸癌的惡性進展有關[24]。CASP3基因編碼的蛋白質是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡的過程中起著核心作用[25]。MAPK1基因是編碼MAP激酶家族的一個成員，MAP激酶也稱為細胞外信號調節(jié)激酶 (ERK)，作為多種生化信號的整合點，參與多種細胞過程，如增殖、分化、轉錄調控和發(fā)育[26]。

綜上所述，薏苡仁的抗炎作用是通過多成分、多靶點、多通路進行的，其活性成分與靶點、靶點與疾病靶點、靶點與信號通路之間均存在復雜的關系，對以上相關通路的預測還需通過實驗進一步驗證。