舒芬太尼對(duì)大鼠骨折愈合的影響

李玉斐 馬智聰

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，通過(guò)激動(dòng)μ阿片受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛效果是芬太尼的5～10倍，且對(duì)呼吸和循環(huán)功能抑制較輕，可以降低應(yīng)激反應(yīng)因此被廣泛運(yùn)用于骨科術(shù)中及術(shù)后鎮(zhèn)痛[1-3]。有研究證實(shí)舒芬太尼會(huì)抑制機(jī)體內(nèi)P物質(zhì)(SP)[5]、降鈣素相關(guān)基因肽(CGRP)[7]及c-fos基因[6,7]等的表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，而這些基因和細(xì)胞因子在促進(jìn)骨折愈合的過(guò)程中起到重要作用[5，8-13]。本實(shí)驗(yàn)給予脛骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼處理，旨在研究舒芬太尼對(duì)大鼠骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 48只健康雄性SD大鼠，6周齡，體重(200±25) g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，所有SD大鼠分開飼養(yǎng)在相同鼠籠，每日攝食量相當(dāng)，飲水不限，飼養(yǎng)溫度控制在22℃，12 h光照和12 h黑暗交替,飼養(yǎng)1周。枸櫞酸舒芬太尼注射液(廠家：人福醫(yī)藥，批號(hào)：11A05361)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠脛骨骨折模型的建立：SD大鼠經(jīng)7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉后，于右小腿脛骨中下1/3處使用骨折裝置制造橫形骨折。在右腿脛骨平臺(tái)處脫毛，碘伏消毒，切開皮膚后取適宜長(zhǎng)度的0.8 mm克氏針從脛骨平臺(tái)穿入髓腔，手法復(fù)位后逆行穿入骨折遠(yuǎn)端并固定，0.9%氯化鈉溶液沖洗后縫合切口。術(shù)后大鼠肌內(nèi)注射青霉素8萬(wàn)U/100 g，1次/d，連續(xù)肌內(nèi)注射3 d，然后分籠飼養(yǎng)，死亡大鼠由備用同系大鼠在相同處理后補(bǔ)充。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥：將制備好脛骨骨折模型的48只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射舒芬太尼10 μg/kg,稀釋至0.5 ml)和對(duì)照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.5 ml)2組,每組24只,術(shù)后第1天起開始給藥，每天早8∶00和晚20∶00給藥，每次給藥間隔12 h，2次/d。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及觀察：術(shù)后第7天、14天、28天，分別從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)選取8只大鼠，經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，頸動(dòng)脈置管取血，將所取血液離心后取血清于-20℃冰箱保存。處死大鼠后取右下肢拍X線片觀察骨折愈合程度。然后取右脛骨，剔除干凈軟組織，用4%多聚甲醛固定24 h后使用EDTA脫鈣液脫鈣1個(gè)月，在脛骨骨痂遠(yuǎn)近各1 cm處截取脛骨，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察大鼠骨折部位的骨組織學(xué)特征。

1.2.4 ELISA法檢驗(yàn)大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)水平。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)表達(dá)水平，電子顯微鏡下進(jìn)行圖像采集和分析。

2 結(jié)果

2.1 X線片比較

2.1.1 術(shù)后1周：實(shí)驗(yàn)組骨折線清晰可見(jiàn)；對(duì)照組斷端稍模糊，出現(xiàn)輕度骨膜反應(yīng)，但無(wú)骨痂生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.1.2 術(shù)后2周：實(shí)驗(yàn)組骨折線較清晰；對(duì)照組骨折線模糊，有少量骨痂形成。見(jiàn)圖2。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.1.3 術(shù)后4周：實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量骨痂包繞斷端，但仍能看到骨折線；對(duì)照組骨折線完全消失，斷端可見(jiàn)大量外骨痂及少量骨橋連接骨折兩端。見(jiàn)圖3。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.2 HE染色組織學(xué)比較

2.2.1 術(shù)后1周：實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)少量軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞；對(duì)照組可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞聚集現(xiàn)象，可見(jiàn)少量新生骨組織形成。見(jiàn)圖4。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.2.2 術(shù)后2周：實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁數(shù)量較少,排列紊亂；對(duì)照組可見(jiàn)較多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁寬度、數(shù)量多于實(shí)驗(yàn)組。見(jiàn)圖5。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.2.3 術(shù)后4周:實(shí)驗(yàn)組有較多成纖維細(xì)胞形成，但成熟骨小梁仍較少；對(duì)照組有大量成纖維細(xì)胞和骨小梁形成，骨小梁明顯增多、增厚，形成編織骨，并向成熟板層骨轉(zhuǎn)化。見(jiàn)圖6。

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組

2.3 血清ALP及TGF-β1含量比較 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清堿ALP和TGF-β1含量在1周、2周、4周時(shí)均明顯降低(P<0.05。見(jiàn)表1、2。

表1 舒芬太尼對(duì)脛骨骨折大鼠血清堿性磷酸酶含量的影響

表2 舒芬太尼對(duì)脛骨骨折大鼠血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1含量的影響

2.4 骨折部位骨組織中BMP-2表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠BMP-2表達(dá)水平在1周、2周、4周時(shí)均明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3，圖7。

表3 舒芬太尼對(duì)脛骨骨折大鼠骨折部位BMP表達(dá)水平的影響

實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組

3 討論

舒芬太尼是1974年合成,1976年被首次報(bào)道的芬太尼N2-4噻吩基衍生物，通過(guò)激動(dòng)特異性μ阿片受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[2]。舒芬太尼鎮(zhèn)痛效價(jià)約為芬太尼5～10倍，是目前鎮(zhèn)痛效應(yīng)最強(qiáng)的阿片類藥物，其脂溶性強(qiáng)，血漿蛋白結(jié)合率高，對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及血流動(dòng)力學(xué)抑制作用較芬太尼輕，被廣泛運(yùn)用于骨科、心血管外科及產(chǎn)科等手術(shù)和術(shù)后鎮(zhèn)痛[3]。

舒芬太尼可以通過(guò)作用于人體大腦、腦干和脊髓等部位的阿片受體，抑制P物質(zhì)(SP)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)及c-fos基因等的表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。研究表明μ阿片受體激動(dòng)劑可以通過(guò)使電壓門控Ca2+通道失活抑制NMDA受體誘導(dǎo)的P物質(zhì)釋放[4]。P物質(zhì)(SP)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)傳遞疼痛信息，激活傷害性感受神經(jīng)元，發(fā)揮致痛作用。P物質(zhì)可以作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞上的NK-1受體，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，從而促進(jìn)骨形成[8]；也作用于骨髓巨噬細(xì)胞上的NK-1受體，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，從而促進(jìn)骨吸收[9]，通過(guò)促進(jìn)骨形成和骨吸收，加速骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨折愈合。王懿春等[5]實(shí)驗(yàn)證實(shí)鞘內(nèi)注射舒芬太尼可以抑制大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的表達(dá)。降鈣素基因相關(guān)肽作為疼痛因子參與多種慢性疼痛的形成，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生，通過(guò)cAMP/PKA途徑增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞的礦化和堿性磷酸酶的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖[10]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)還可以通過(guò)促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)，加速骨折愈合[11]。c-fos原癌基因?qū)儆诩纯淘缙诨?IECs)家族，很多研究表明傷害性刺激可以誘導(dǎo)c-fos基因的表達(dá)，c-fos基因的表達(dá)產(chǎn)物Fos蛋白可與Jun蛋白結(jié)合形成fos/jun異源二聚體AP-1，識(shí)別細(xì)胞表面的TRE位點(diǎn)，啟動(dòng)TGF-β等因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合[11，12]。而全身或局部應(yīng)用阿片類藥物會(huì)抑制大腦皮質(zhì)、海馬和脊髓c-fos基因的表達(dá)，且其抑制作用可以被阿片受體拮抗劑納洛酮逆轉(zhuǎn)[6,7]。

隨著社會(huì)發(fā)展和交通工具的變革，骨折患者的數(shù)量越來(lái)越多，在積極治療骨折的基礎(chǔ)上，緩解骨折患者的疼痛也越來(lái)越重要。目前臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥物主要有非甾體抗炎藥和中樞性鎮(zhèn)痛藥，大量研究表明非甾體抗炎藥在鎮(zhèn)痛的同時(shí)會(huì)延緩骨折愈合[14，15]。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)舒芬太尼會(huì)抑制骨折愈合相關(guān)的基因和細(xì)胞因子的表達(dá)，而關(guān)于中樞性鎮(zhèn)痛藥對(duì)骨折愈合的影響，筆者所見(jiàn)國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)脛骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼處理，并與注射等量0.9%氯化鈉溶液的空白組大鼠進(jìn)行對(duì)比，旨在研究舒芬太尼時(shí)候會(huì)抑制骨折愈合。X線片顯示術(shù)后1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折線清晰可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠骨折斷端稍模糊，出現(xiàn)輕度骨膜反應(yīng)，但無(wú)骨痂生長(zhǎng)。術(shù)后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折線較清晰，對(duì)照組大鼠骨折線模糊，有少量骨痂形成。術(shù)后4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠可見(jiàn)大量骨痂包繞斷端，但仍能看到骨折線，對(duì)照組大鼠骨折線完全消失，骨折斷端可見(jiàn)大量外骨痂及少量骨橋連接骨折兩端。HE染色組織學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)少量軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞，對(duì)照組出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞聚集現(xiàn)象，可見(jiàn)少量新生骨組織形成。術(shù)后2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁數(shù)量較少,排列紊亂，對(duì)照組可見(jiàn)較多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁寬度、數(shù)量多于實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后4 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組有較多成纖維細(xì)胞形成，但成熟骨小梁仍較少，對(duì)照組有大量成纖維細(xì)胞和骨小梁形成，骨小梁明顯增多、增厚，形成編織骨，并向成熟板層骨轉(zhuǎn)化。

ALP可以分解有機(jī)磷酸化合物產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸鹽離子，并與鈣離子結(jié)合成磷酸鈣沉淀于骨組織內(nèi)，促進(jìn)骨折愈合。堿性磷酸酶由成骨細(xì)胞分泌后可以滲入血液，使血清堿性磷酸酶含量增高，故血清堿性磷酸酶可以作為評(píng)價(jià)骨折愈合的指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清堿性磷酸酶含量1周時(shí)開始上升，2周時(shí)含量最高，4周時(shí)逐漸降低，且在術(shù)后1周、2周、4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清堿性磷酸酶含量均低于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-β1)廣泛存在于正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，以骨細(xì)胞和血小板中含量最多。TGF-β1存在于大鼠骨折愈合的各個(gè)階段，調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等多種骨細(xì)胞的增殖、分化，在骨折愈合過(guò)程中起到重要作用[17]。本實(shí)驗(yàn)中，血清TGF-β1含量在術(shù)后1周、2周、4周不斷增高，且實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清TGF-β1含量均低于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BMP是TGF-β超家族中的一種酸性多肽，也是目前最強(qiáng)的成骨因子，其中BMP-2是BMP中研究最多的亞型，也是成骨作用最強(qiáng)的亞型,可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨折愈合[18]。 本實(shí)驗(yàn)中，在術(shù)后1周、2周、4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠的骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)水平均低于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，舒芬太尼處理的脛骨骨折大鼠在影像學(xué)和組織形態(tài)學(xué)上骨折愈合程度低于單純脛骨骨折大鼠，且同一時(shí)間段，舒芬太尼處理的脛骨骨折大鼠血清ALP含量、血清TGF-β1含量及骨組織BMP-2表達(dá)水平低于單純脛骨骨折大鼠。故本實(shí)驗(yàn)證實(shí)舒芬太尼會(huì)抑制脛骨骨折大鼠的骨折愈合，應(yīng)慎用于骨折患者的鎮(zhèn)痛治療，尤其是老年人、骨質(zhì)疏松患者等易發(fā)生骨折延遲愈合或骨折不愈合的患者。舒芬太尼對(duì)骨折愈合的抑制作用可能是通過(guò)抑制P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽及c-fos基因等的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，關(guān)于舒芬太尼抑制骨折愈合的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。