壯方柔肝化纖顆粒對(duì)CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型的干預(yù)效應(yīng)及其對(duì)α-SMA、E-Cadherin 表達(dá)的影響

張文富，吳姍姍，戴 銘，呂建林，黃晶晶，李曉龍，王振常2，

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530299；3.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299；5.廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530299；6.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精性肝病等各種慢性肝病進(jìn)展的必經(jīng)過(guò)程，同時(shí)也是進(jìn)展為肝硬化，甚至是肝癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。早期抗纖維化干預(yù)治療，可有效改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，并在一定程度上降低肝硬化與肝細(xì)胞癌的發(fā)病概率，延長(zhǎng)患者壽命。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制在各類(lèi)慢性肝臟疾病的起始和進(jìn)展過(guò)程中均起著關(guān)鍵作用［1，2］。氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的激活可導(dǎo)致眾多炎癥因子的釋放［3］，而炎癥因子的大量釋放不僅會(huì)導(dǎo)致炎癥的一系列連鎖反應(yīng)，還能造成氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活，繼而加重肝纖維化與肝硬化程度［4］，相反，抑制氧化應(yīng)激與減輕炎癥反應(yīng)可以在一定程度上減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化［5，6］。因此，降低氧化應(yīng)激與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。國(guó)內(nèi)外研究顯示，一些中藥單體或中藥復(fù)方能有效改善甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化患者肝組織病理學(xué)進(jìn)程［8-13］。經(jīng)國(guó)家級(jí)第一批名老中醫(yī)林沛湘教授對(duì)肝病多年研究總結(jié)的“壯肝逐瘀煎”與全國(guó)首批名老中醫(yī)關(guān)幼波教授多年來(lái)用于治療肝纖維化、肝硬化有效驗(yàn)方化裁而成的壯方柔肝化纖顆粒，由生黃芪、生牡蠣、老虎姜、枸杞子、薏苡仁、蕓紅、地瓜苗、上甲、虎杖、雞黃皮、大棗等十一味藥組成，有攻毒補(bǔ)虛之功效，使壯醫(yī)理論之“氣道”、“谷道”、“水道”三道通暢。前期研究已證實(shí)柔肝化纖顆?？筛纳聘卫w維化、肝硬化、肝癌患者的臨床癥狀［14-16］，有助于乙肝肝硬化患者利尿消腫與減少腹水的生成［17］，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究采用CCl4聯(lián)合花生油復(fù)合溶液聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化大鼠，剖析柔肝化纖顆粒對(duì)肝纖維化大鼠的干預(yù)效應(yīng)，以本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究的氧化應(yīng)激水平為切入點(diǎn)，深入探討柔肝化纖顆粒抗肝纖維化的作用效應(yīng)，為柔肝化纖顆粒治療肝纖維化提供切實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取體重100～120 g 的SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠48 只，均購(gòu)買(mǎi)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。飼養(yǎng)室溫度設(shè)定值為19.2 ℃，相對(duì)濕度設(shè)定值為49.8%，壓力設(shè)定值為0.9 Pa，送風(fēng)風(fēng)速目標(biāo)值為7.1 m/s，排風(fēng)風(fēng)速目標(biāo)值為3.6 m/s，換氣次數(shù)目標(biāo)值為70 次/h，風(fēng)量比例目標(biāo)值為50%，光照時(shí)間與黑暗時(shí)間對(duì)等，常規(guī)環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間由大鼠自主飲水與進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 桂2020-0003；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK 桂2020-0004。

1.1.2 試劑耗材 環(huán)保型浸蠟脫蠟透明液（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，200801），脫水劑Ⅰ（75%乙醇）（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，200801），脫水劑Ⅱ（85% 乙醇）（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，190604），脫水劑Ⅲ（95%乙醇）（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，191101），脫水劑Ⅳ（無(wú)水乙醇）（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，200901），蘇木精染液（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，191202），無(wú)毒環(huán)保蘇木素-伊紅（HE）染色液（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，200901），中性環(huán)保速干膠（南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司，180502），無(wú)毒環(huán)保馬松（Masson）三色染色液（Solarbio，G1340），PBS 緩 沖 液 干 粉（Solarbio，P1010），EDTA 抗 原 修 復(fù) 液（50X）（Solarbio，C1034），30%過(guò)氧化氫（成都金山化學(xué)試劑有限公司，20190608），山 羊 血 清（Beyotime，C0265），α-SMA Polyclonal Antibody（Elabscience，E-AB-34268），E-Cadherin Polyclonal Antibody（Proteintech，20874-1-AP），Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（abcam，ab6721），DAB 顯色液（中杉金橋，ZLI-9018），CCl4（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，20210218），ALT、AST 檢測(cè)試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司，20210822，20210912），α-SMA免疫組化試劑盒（中杉金橋，ZM-0003），E-Cadherin免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，2105190738b），超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（吉林百奧生物科技有限公司，9054-89-1），丙二醛（MDA）測(cè)試盒（吉林百奧生物科技有限公司，XF03124B）。

1.1.3 藥物 壯方柔肝化纖顆粒，由壯方柔肝化纖顆粒，由生黃芪45 g、生牡蠣30 g、老虎姜20 g、枸杞子20 g、薏苡仁45 g、蕓紅12 g、地瓜苗30 g、上甲30 g、虎杖20 g、雞黃皮15 g、大棗15 g 組成。所選取的藥物為免煎顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），由廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部中心藥房提供，入庫(kù)的所有中藥依據(jù)2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》第一部?jī)?nèi)容鑒定，選取道地藥材，符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.4 器材 賽默飛世爾脫水機(jī)（英國(guó)賽默飛，Excelsior AS），萊卡組織切片機(jī)（上海萊卡，2235），萊卡組織攤片機(jī)（上海萊卡，HI1210），萊卡組織烤片機(jī)（上海萊卡，HI1210），一恒電熱干燥箱（上海一恒，DHG-9091A），恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢，DHP-90052），通風(fēng)柜（廣州匯綠，630），霉菌培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，MJ-150-Ⅱ）；普通PCR 儀（Bio-RAD，T100）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（RT-PCR）（杭 州 安 譽(yù)AGS8830-16）；電 泳 儀（Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra System），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯，BX-53）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（日本奧林巴斯，U-RFL-T）。

1.2 方法

1.2.1 分組 根據(jù)采取隨機(jī)數(shù)字表法，將48 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白組、病理模型組與柔肝化纖顆粒組，每組均為16 只。

1.2.2 造模與給藥 病理模型組與柔肝化纖顆粒組Wistar 大鼠采取皮下注射40%的CCl4聯(lián)合花生油復(fù)合因素誘導(dǎo)下，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)肝纖維化實(shí)驗(yàn)操作。動(dòng)物造模方法參照馬學(xué)惠［18］與呂艷杭［19］法規(guī)范操作，第一次皮下注射5 mL/kg，之后間隔3 天以每3 mL/kg 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮下注射，每周注射2 次，連續(xù)8 周。并且每天予高脂、低蛋白輔食（予玉米面為日?；A(chǔ)食物，在第1、第2 周添加予0.5%膽固醇與20%豬油）喂養(yǎng)，為了充分而有效避免大鼠肝纖維化模型的自然恢復(fù)從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性造成的不良影響，造模成功后仍按3 mL/kg 的標(biāo)準(zhǔn)每周皮下注射一次40% CCl4油劑；空白組除了正常喂養(yǎng)以外，在相同時(shí)間皮下注射等劑量花生油，8 周后按照8 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)給予生理鹽水灌胃。造模成功后，中藥使用劑量參照Wojcikowski Ken［20］動(dòng)物用藥劑量的換算方法實(shí)施，病理模型組給予8 mg/kg 生理鹽水灌胃，柔肝化纖顆粒組給予該中藥方的顆粒溶液同樣按8 mg/kg 的劑量進(jìn)行灌胃，每周灌胃3 次，連續(xù)8 周。

1.2.3 標(biāo)本采集 按照造模與給藥方法對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)第8 周末當(dāng)晚，各組大鼠均禁食但不禁水12 h，予1%戊巴比妥注射液（5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，10 min 后對(duì)大鼠進(jìn)行夾尾試驗(yàn)，不動(dòng)彈方可判斷為麻醉起效。在大鼠軀干前面腹部正中間按“T”字形狀小心剪開(kāi)，完整顯露出腹主動(dòng)脈后進(jìn)行采血，采血完畢后將血液靜置于室溫1 h，靜置后，于3000 r/min，按照離心半徑參數(shù)為10 cm的設(shè)置，離心15 min。采用移液槍吸取血清，取大鼠肝組織標(biāo)本開(kāi)展下一步操作。

1.2.4 肝功能轉(zhuǎn)氨酶水平檢測(cè) 嚴(yán)格參照ALT 與AST 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行，檢測(cè)三組大鼠血清 ALT、AST 指標(biāo)。

1.2.5 肝組織病理切片制備 充分選取大鼠肝組織中右葉最厚處，切取標(biāo)本約0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm 肝組織1 塊，將選取的肝組織放入4 %的多聚甲醛溶液中固定12 h，采用自動(dòng)脫水機(jī)連續(xù)4 次進(jìn)行逐級(jí)酒精脫水，將組織浸入于二甲苯溶液中透明組織，再使用石蠟將組織充分包埋，采用切片機(jī)將石蠟包埋組織切成4 μm 厚的切片，放置在干凈的載玻片上，然后將其置于60 ℃的恒溫箱中孵育，5 h 后將其取出，放于4 ℃冰箱中保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 HE 染色 使用二甲苯脫蠟10 min，結(jié)束后將其充分沖洗后使用蘇木精有效染色，時(shí)間約4～6 min，根據(jù)實(shí)際染色情況適當(dāng)增加或縮短染色時(shí)間，使用流動(dòng)水沖洗干凈蘇木精溶液，使用分化液將組織分化后再用流水沖洗組織，滴加少量乙酸至鋪滿載玻片上的組織為宜，組織分化結(jié)束后顏色逐漸變淺為藍(lán)色，再將其放入0.1%氨水水溶液中返藍(lán)，直至變成藍(lán)色后流水沖洗，觀察著色情況，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色后，0.5%伊紅染色再?zèng)_洗，觀察著色情況，細(xì)胞漿著色呈粉色后，放入75%、85%、95%、100%酒精中脫水，晾干后置于二甲苯中，晾干后滴上中性樹(shù)膠封片。

1.2.7 Masson 染色 二甲苯脫蠟，沖洗后蘇木素染色，沖洗后再用5%乙酸分化，沖洗并滴加乙酸，組織分化結(jié)束后顏色逐漸變淺成藍(lán)色，再使用Masson藍(lán)化液對(duì)組織進(jìn)行返藍(lán)，采用光學(xué)顯微鏡觀察組織染色結(jié)果，被著色的細(xì)胞核部位呈現(xiàn)出藍(lán)黑色，再將以上組織置于Masson 麗春紅酸性品紅液中進(jìn)行充分染色，接著使用乙酸水溶液進(jìn)行沖洗，然后使用磷鉬酸水溶液再次將其分化，按照蒸餾水與弱酸溶液比例為2∶1 的方法進(jìn)行配置弱酸工作液有效沖洗，采用苯胺藍(lán)染色液進(jìn)行二次染色，工作液沖洗后脫水晾干并放在二甲苯中透明3 次，最后將其自然晾干再用中性樹(shù)膠封片。

1.2.8 免疫組化 將組織先進(jìn)行脫水處理，包埋，待蠟塊完全凝固后存放備用。組織切片，厚度為3 μm，撈片，65 ℃烤片過(guò)夜。切片常規(guī)脫蠟至水，依次放入脫蠟液Ⅰ、脫蠟液Ⅱ、脫蠟液Ⅲ、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%、75%乙醇、自來(lái)水中清洗。洗片，EDTA 抗原有效修復(fù)，3%H2O2室溫充分孵育15 min，洗片以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%正常山羊血清涂覆樣本，置于濕盒中37 ℃封閉1h。進(jìn)行一抗孵育時(shí)，采用封閉液稀釋好的α-SMA 抗體（1∶200）或E-Cadherin 抗體（1∶1 000）滴在載玻片上鋪滿組織，4 ℃孵育過(guò)夜。進(jìn)行二抗孵育時(shí)，37 ℃孵育30 min 再洗片。加入DAB 顯色液，在顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，沖洗返藍(lán)，依次脫水再風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.2.9 ELISA 嚴(yán)格參照SOD ELISA 試劑盒與MDA ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，檢測(cè)各組大鼠的SOD 與MDA 指標(biāo)。

1.2.10 RT-PCR 測(cè)定肝組織α-SMA mRNA、E-Cadherin mRNA 表 達(dá) 稱 取100 mg 大 鼠 肝 臟 標(biāo)本，根據(jù)Trizol 法提取總RNA，總反應(yīng)體系為20 μL，將其置入42 ℃水浴1 h，充分逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。選用所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL 作為提取的反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件設(shè)置參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，接著94 ℃變性40 s，然后60 ℃退火40 s，接著72 ℃延伸1 min，連續(xù)35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。β-action 內(nèi)參擴(kuò)增設(shè)置參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，接著94 ℃變性40 s，然后60 ℃退火40 s，接著72 ℃延伸1 min，連續(xù)32 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。將5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，攝像、存儲(chǔ)并分析。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Tab 1 Primer design

1.2.11 蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot）使用電子天平稱取40 mg 大鼠肝組織，于10 mL 的裂解液中加入蛋白酶抑制劑，冰盒上裂解，研磨勻漿，低速離心，取上清液，即得肝組織總蛋白。使用大鼠BCA蛋白ELISA 試劑盒，測(cè)定總蛋白濃度后，對(duì)蛋白進(jìn)一步電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等相關(guān)操作，使用β-微管蛋白作為內(nèi)參，按增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法對(duì)其進(jìn)一步曝光顯影成像，分析目的蛋白條帶和內(nèi)參的灰度值比值，采用GeneTools 圖像分析管理系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行半定量分析并儲(chǔ)存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)研究運(yùn)用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)比較分析，鑒于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所比較的計(jì)量資料為獨(dú)立樣本，且所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)正態(tài)分布，所以兩組數(shù)據(jù)間相比的計(jì)量資料予采用t 檢驗(yàn)，組間的比較予采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。在符合獨(dú)立樣本、正態(tài)性分布且方差齊的情況下，多組間相比較采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）。方差不齊時(shí)，采用均值相等性的鍵壯性檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)以再次驗(yàn)證本研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)圖形處理采用Graphpad Prism 9.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 柔肝化纖顆粒治療CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝損傷情況

經(jīng)柔肝化纖顆粒干預(yù)后，病理模型組與空白組大鼠相比較，病理模型組大鼠肝功能ALT、AST 兩個(gè)指標(biāo)值均顯著升高（P均＜0.001）；但柔肝化纖顆粒組與病理模型組大鼠相比，ALT、AST 兩個(gè)指標(biāo)值均明顯降低（P均＜0.001）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)比較（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)比較（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與病理模型組比較，▲P＜0.01。

指標(biāo)ALT（U/L）AST（U/L）空白組（n=16）55.16±3.53 179.25±28.51病理模型組（n=16）225.29±69.09*317.30±82.88*柔肝化纖顆粒組（n=16）159.12±52.80▲219.64±56.75▲FP＜0.001＜0.001 46.62 22.18df20.14 25.42

2.2 HE 染色結(jié)果

光鏡下顯示（圖1）：空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)排列完整有序，肝細(xì)胞大小與形態(tài)表現(xiàn)正常，肝細(xì)胞索均勻圍繞中央靜脈呈放射狀有一定規(guī)律地排列，未見(jiàn)出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及肝臟纖維組織增生，可見(jiàn)極少量炎細(xì)胞輕度浸潤(rùn)。病理模型組大鼠肝組織內(nèi)的小葉結(jié)構(gòu)已殘缺，出現(xiàn)眾多肝臟纖維組織異常增生，增生所形成的膠原纖維匯合成密集的纖維間隔，從而變成假小葉結(jié)構(gòu)，假小葉結(jié)構(gòu)內(nèi)部出現(xiàn)大量形態(tài)各異、大小不均的脂肪變性的肝細(xì)胞，炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)顯著。與病理模型組相比，經(jīng)過(guò)干預(yù)后的柔肝化纖顆粒組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞的面積顯著減少，正常肝小葉結(jié)構(gòu)增多，有不同程度增生的膠原纖維組織出現(xiàn)在中央靜脈至匯管區(qū)，纖維間隔相對(duì)疏松，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)程度較病理模型組減輕。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色結(jié)果（×400）Fig 1 HE staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.3 Masson 染色結(jié)果

光鏡下顯示（圖2）：空白組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，細(xì)胞排列正常有序，僅在中央靜脈區(qū)域的血管壁附近可見(jiàn)少許藍(lán)色膠原纖維稀疏排列。病理模型組大鼠肝組織清晰顯示出眾多異常增生的藍(lán)色膠原纖維，不規(guī)律包圍環(huán)繞、分隔肝小葉組織，形成大小不等的假小葉結(jié)構(gòu)。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織亦可見(jiàn)藍(lán)色膠原纖維出現(xiàn)在匯管區(qū)域內(nèi)，纖維細(xì)薄，從中央靜脈向四周延伸蔓延，膠原纖維增生較病理模型組有很大程度的減輕。

圖2 各組大鼠肝組織Masson 染色結(jié)果（×400）Fig 2 Masson staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.4 免疫組化結(jié)果

α-SMA 蛋白表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)為主，著色為棕黃色。光鏡下顯示，大鼠肝組織中α-SMA 僅可見(jiàn)少量表達(dá)，僅存在于匯管區(qū)小動(dòng)脈與小靜脈血管壁上，其余組織區(qū)域未發(fā)現(xiàn)明顯表達(dá)。病理模型組大鼠肝組織中α-SMA 呈強(qiáng)陽(yáng)性高表達(dá)狀態(tài)，在匯管區(qū)與膠原纖維增生處清晰可見(jiàn)其大量密集分布，并且在假小葉及增生的纖維間隔內(nèi)可見(jiàn)大量α-SMA 表達(dá)。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織α-SMA 少量表達(dá)于匯管區(qū)血管壁、纖維間隔中，肝竇處亦有少許分布，表達(dá)的強(qiáng)度及范圍較病理模型組顯著減少（圖3）。E-Cadherin 陽(yáng)性染色顯示區(qū)域主要定位于細(xì)胞膜上，一般著色為棕黃色。光鏡下，大鼠肝組織E-Cadherin 呈高表達(dá)，病理模型組大鼠肝組織E-Cadherin 呈低表達(dá)或缺失，柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織E-Cadherin 表達(dá)較模型組有不同程度的升高（圖4）。

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA 免疫組化結(jié)果（×400）Fig 3 Liver tissue of rats in each group α- SMA immunohistochemical results（×400）

圖4 各組大鼠肝組織E-Cadherin 免疫組化結(jié)果（×400）Fig 4 Immunohistochemical results of E-cadherin in liver tissue of rats in each group（×400）

2.5 ELISA 結(jié)果

SOD 與MDA 是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。經(jīng)柔肝化纖顆粒干預(yù)后，柔肝化纖顆粒組SOD 水平較病理模型組明顯升高（P＜0.001）。柔肝化纖顆粒組MDA 水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001）。見(jiàn)表3，圖5。

圖5 各組大鼠肝組織SOD 與MDA 水平比較Fig 5 Comparison of SOD and MDA levels in liver tissue of rats in each group

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01。

指標(biāo)FP空白組（n=16）病理模型組（n=16）柔肝化纖顆粒 組（n=16）dfSOD（IU/mL）MDA（nmol/L）542.75±69.46 297.72±60.45 162.20±21.73*1 095.13±185.76*398.45±66.05▲671.54±180.84▲＜0.001＜0.001 183.40 107.82 23.50 23.66

2.6 RT-PCR 與Western Blot 結(jié) 果

柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織中α-SMA 的表達(dá)水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001）。柔肝化纖顆粒組大鼠肝組織中E-Cadherin 的表達(dá)水平較病理模型組明顯升高（P＜0.001）。

圖6 α-SMA、E-Cadherin 的表達(dá)Fig 6 Expression of α-SMA and E-Cadherin

3 討論

肝纖維化的誘因是形式多樣的，發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜［21］，形成過(guò)程也多樣化。中醫(yī)辨證認(rèn)為［22，23］，肝纖維化的中醫(yī)病機(jī)為“虛、瘀、毒”。研究證實(shí)［24-30］，有些中藥單品及中成藥有保肝護(hù)肝的作用，在一定程度上可產(chǎn)生抗肝纖維化的療效。壯方柔肝化纖顆粒的主要功效是“攻毒補(bǔ)虛”，對(duì)辯證治療肝纖維化的病因病機(jī)是相符的，前期研究已證實(shí)［14-17］，此方對(duì)肝纖維化、肝硬化、腹水等慢性肝病及其并發(fā)癥有顯著的療效，但其作用機(jī)制尚未明確。

很多病因可以直接或間接導(dǎo)致肝纖維化，氧化應(yīng)激反應(yīng)就是其中一種常見(jiàn)的病因。研究顯示［31-33］，氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活可致使眾多炎癥因子的釋放，其是肝纖維化形成的常見(jiàn)病理生理變化之一，而大量炎癥因子的不斷釋放既可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，又能引起氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活，繼而使肝纖維化程度加重，并逐步向肝硬化進(jìn)展。氧化應(yīng)激系統(tǒng)是引起肝臟損傷與導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化的重要因素之一。同樣，形式多樣的發(fā)病誘因亦可激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)，因此，減輕氧化應(yīng)激系統(tǒng)的過(guò)分活躍是抑制肝纖維化程度的有效控制措施。國(guó)內(nèi)外多方面研究證實(shí)［34-38］，肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖及活化是肝纖維化、肝硬化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肝纖維化的不斷分化可加重成肝硬化，甚至惡變成肝癌，所以減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程是防治肝硬化與肝癌必 不 可 少 的 環(huán) 節(jié)［39，40］。而SOD 作 為 機(jī) 體 代 謝 中 氧化物自由基最關(guān)鍵的歧化酶之一，不僅對(duì)活化的HSC 產(chǎn)生巨大影響，還能導(dǎo)致多系統(tǒng)激活從而減少肝細(xì)胞凋亡［41，42］：主要體現(xiàn)在SOD 活躍程度減退后導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物在多種金屬離子產(chǎn)物與酶活性的作用下分化降解，使MDA 分泌過(guò)盛，MDA 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而跟蛋白質(zhì)分子進(jìn)行交聯(lián)，進(jìn)一步誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡［43，44］。為此本研究通過(guò)探索壯方柔肝化纖顆粒干預(yù)CCl4肝纖維化大鼠模型，剖析柔肝化纖顆粒在抗肝纖維化病理進(jìn)展中所發(fā)揮的效應(yīng)及其作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化模型組Wistar 大鼠血清的 ALT、AST 等指標(biāo)水平明顯升高，通過(guò)柔肝化纖顆粒干預(yù)后轉(zhuǎn)氨酶能有效下降，表明柔肝化纖顆?？赏ㄟ^(guò)保護(hù)大鼠肝功能而起到防治肝損傷的作用。HE 染色、Masson 染色與免疫組化結(jié)果提示柔肝化纖顆粒可有效減輕CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的模型大鼠的肝細(xì)胞損害情況，減輕其肝組織炎癥程度，逆轉(zhuǎn)其肝纖維化進(jìn)程。ELISA 結(jié)果顯示柔肝化纖顆粒組SOD水平較病理模型組與空白組明顯升高（P＜0.001），柔肝化纖顆粒MDA 水平較病理模型組明顯下降（P＜0.001），證實(shí)了柔肝化纖顆粒的有效性，其作用機(jī)制與保護(hù)肝功能、降低氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)。

HSC 激活后能加速肝纖維化主要以α-SMA 的表 達(dá) 升 高 作 為 重 要 判 定 指 標(biāo) 之 一［45，46］。α-SMA 是HSC 活化增殖的關(guān)鍵病理學(xué)標(biāo)志和特異性蛋白，α-SMA 的過(guò)度表達(dá)能加速HSC 過(guò)度分泌ECM，從而促使肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展，還能間接反映出HSC 在機(jī)體內(nèi)活化增殖的進(jìn)度與纖維化進(jìn)展的嚴(yán)重程度［47］。α-SMA 表達(dá)水平升高后可直接加速肝纖維化與肝損傷的進(jìn)程，還能作為評(píng)估肝硬化進(jìn)展程度的重要指標(biāo)。本研究表明，經(jīng)CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的α-SMA 表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)過(guò)柔肝化纖顆粒干預(yù)后，α-SMA 的表達(dá)水平與病理模型組相比顯示出明顯下降的分布（P＜0.001），說(shuō)明柔肝化纖顆?？梢种艸SC 的活化增殖，對(duì)肝纖維化有一定的抑制效果。E-cadherin 是肝病的血清生物標(biāo)志物［48］，是一種鈣依賴的、能夠維持上皮組織穩(wěn)定的鈣粘蛋白，在組織分化中形成穩(wěn)定的黏附帶［49］，若其不能充分表達(dá)，則上皮細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，上皮細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生EMT 而影響細(xì)胞的正常代謝，從而轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞。EMT 的中心環(huán)節(jié)是E-cadherin 的過(guò)度抑制，EMT 發(fā)生時(shí)上皮細(xì)胞原有功能也隨之發(fā)生變化，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)與遷移的改變，向間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。發(fā)生EMT 時(shí)，組織細(xì)胞上皮標(biāo)志成分E-cadherin 表達(dá)明顯受到抑制，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志成分神經(jīng)型鈣黏附蛋白（neurotype cadherin，N-cadherin）與α-SMA 表達(dá)升高，E-cadherin 的表達(dá)水平能反映出肝纖維化的程度，其表達(dá)水平越低，說(shuō)明肝纖維化水平越重［50］。TGF-β1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路是HSC 活化與增殖的關(guān)鍵通路［51-53］，TGF-β1 是肝纖維化進(jìn)程中誘發(fā)EMT 的環(huán)節(jié)上其關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子。通過(guò)影響TGF-β1/Smad 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，在細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SRC-1、Twist 的過(guò)分表達(dá)，繼而促使HSC 向EMT進(jìn)展［54］。本研究表明，與空白組比較，肝纖維化模型組α-SMA mRNA 表達(dá)水平顯著增高，E-cadherin mRNA 表達(dá)明顯下降。與病理模型組相比，柔肝化纖顆粒組α-SMA mRNA 表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin mRNA 表達(dá)水平明顯增高，提示柔肝化纖顆?？赡芡ㄟ^(guò)減輕EMT 的發(fā)生從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

綜上所述，柔肝化纖顆粒能有效抑制肝纖維組織增生，降低CCl4聯(lián)合花生油復(fù)合溶液聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清的ALT、AST 水平，其抗肝纖維化機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)肝功能、降低氧化應(yīng)激水平、下調(diào)α-SMA 蛋白的表達(dá)、上調(diào)E-cadherin 蛋白的表達(dá)、抑制細(xì)胞EMT 從而對(duì)CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維大鼠化發(fā)揮治療作用。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。