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    柔肝通絡(luò)湯對腦缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2蛋白表達的影響*

    2021-02-06 10:41:42龍華君帥文昊張珊珊胡國恒
    中國中醫(yī)急癥 2021年1期
    關(guān)鍵詞:湯高柔肝通絡(luò)

    楊 穎 龍華君 劉 雨 帥文昊 張珊珊 胡國恒

    (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410006;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

    腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦組織缺血一段時間后,血流再次恢復(fù),而對缺血區(qū)腦組織造成更加嚴(yán)重的損傷,其表現(xiàn)為神經(jīng)細胞損害和腦功能障礙的進一步加重。研究表明,缺血再灌注損傷的機制與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子反應(yīng)、細胞凋亡和自噬等因素有關(guān),其中B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)作為一種至關(guān)重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護因子,它的表達與腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的存活有著密不可分的聯(lián)系[1-2]。陳芬芳等[3]研究證實Bcl-2可以通過多種途徑干預(yù)細胞凋亡,其表達能影響細胞的存活與滅亡。柔肝通絡(luò)湯的組成遵循“肝腎同源、從腎治腦、腎腦同治”理論,總結(jié)多年的臨床經(jīng)驗教訓(xùn),對臨床治療缺血性腦卒中起到了顯著療效。本研究旨在探討不同劑量的柔肝通絡(luò)湯對腦缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2蛋白表達的影響,研究柔肝通絡(luò)湯干預(yù)腦缺血再灌注損傷的作用機制,為中醫(yī)臨床方藥的應(yīng)用推廣提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選用健康雄性Sprague-Dqwley(SD)大鼠78只,體質(zhì)量250~300 g,鼠齡為18月,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SYXK(湘)2015-0003,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥研究院中藥研究所SPF級實驗室,室溫18~20℃,濕度65%~70%,每日喂水喂食。

    1.2 試藥與儀器

    1)藥物:柔肝通絡(luò)湯組方:桑椹15 g,制首烏15 g,枸杞子 30 g,丹參 30 g,當(dāng)歸尾 10 g,赤芍 10 g,山楂15 g,葛根30 g,地龍10 g,均來自湖南中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。上述藥材煎煮2次,第1次加水量為500 mL,第2次為300 mL,均煎至150 mL;2次煎液去渣濾凈后混合,以文火煎至黏稠狀(內(nèi)含生藥2 g/mL),冷藏。2)試劑及儀器:MCAO線栓(北京西濃生物科技);常規(guī)生物化學(xué)實驗試劑(上海國藥生物);中性樹膠(美國Sigma);PBS(谷歌生物);枸櫞酸鹽緩沖液、蘇木素、伊紅(美國Wellbio);免疫組化二步法試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋);恒溫箱(北京六一);包埋機(武漢俊杰電子);顯微鏡(美國Motic)。

    1.3 造模及分組

    1)動物分組:按照體質(zhì)量將大鼠進行分層,然后遵循隨機數(shù)字表法將其分成假手術(shù)組(6只大鼠)、模型組(18只大鼠)、柔肝通絡(luò)湯高劑量組(18只大鼠)、柔肝通絡(luò)湯中劑量組(18只大鼠)、柔肝通絡(luò)湯低劑量組(18只大鼠),其中模型組及柔肝通絡(luò)湯各劑量組再根據(jù)腦缺血再灌注后3、12、24 h時間點分3個亞組(每個亞組6只)。2)模型制備:參照改良Longa法將模型組及柔肝通絡(luò)湯高劑量、柔肝通絡(luò)湯中劑量、柔肝通絡(luò)湯低劑量組大鼠制成大腦中動脈堵塞(MCAO)模型,MCAO線栓從大鼠的右側(cè)頸總動脈插入,由頸內(nèi)外動脈分叉部計(18.5±0.5)mm,插入大腦前動脈,以阻斷大腦中動脈血流;假手術(shù)組則將栓線插入15 mm以內(nèi),不能完全阻斷大腦中動脈,其余步驟參照模型組。然后記錄阻斷時間,縫合傷口,外留線栓10mm,在2 h后輕拔出線栓約10 mm,即再灌注模型建立完成。模型建立成功的3項指標(biāo)為:(1)提尾時左前肢內(nèi)收屈曲;(2)同側(cè)Homer征;(3)爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。最后篩除不成功的動物模型。

    1.4 干預(yù)方法

    依照人和動物體表面積換算的等效劑量比率表,柔肝通絡(luò)湯高劑量、柔肝通絡(luò)湯中劑量、柔肝通絡(luò)湯低劑量組分別于造模前7 d灌胃相應(yīng)劑量的柔肝通絡(luò)湯湯劑(2.8、1.4、0.7 g/100 g生藥含量),假手術(shù)組、模型組均用1.4 g/100 g蒸餾水灌胃,均連續(xù)預(yù)處理灌胃1周,每天1次。末次灌胃給藥后30 min,腹腔麻醉處死,將腦組織取出。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測

    1.5.1 神經(jīng)功能缺損程度評分 按再灌注3、12、24 h 3個時間點分別進行Longa神經(jīng)功能缺損程度評分。0分:完全沒有神經(jīng)功能損傷的癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)身體傾倒;4分:失去意識,無法自主行走。

    1.5.2 梗死側(cè)腦組織觀察 將梗死側(cè)腦組織常規(guī)固定,石蠟包埋切片,梯度酒精脫水,蘇木素染色,水洗,用1%鹽酸酒精分化,水洗,伊紅染色,水洗,梯度酒精脫水至透明干燥,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察、攝像。

    1.5.3 梗死側(cè)腦組織Bcl-2蛋白免疫組化染色(SP法) 將梗死側(cè)腦組織常規(guī)固定,石蠟包埋切片,梯度酒精脫水,蒸餾水洗片3 min×2,高溫高壓條件下抗原修復(fù),切片后加3% H2O2甲醇液,在室溫下反應(yīng)10 min,PBS洗片 3 min×3,甩去,加封閉型動物血清 50 μL,37℃下孵育10 min,甩去,加一抗50 μL,4℃下孵育18 h,PBS洗片5 min×3,甩去,加生物素標(biāo)記二抗50 μL,37 ℃下孵育10 min,PBS洗片3 min×3,甩去,加鏈親和素-過氧化物酶溶液50 μL,37℃下孵育10 min,PBS洗片5 min×3,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染10 s,常規(guī)脫水、透明、封片。采用光學(xué)顯微鏡對梗死側(cè)海馬區(qū)腦組織進行成像,每張切片選擇5個400倍視野范圍,并在每個視野范圍內(nèi)對Bcl-2染色陽性細胞進行觀察(胞漿或胞核有棕色顆粒者),Image-Pro Plus軟件計算出每個視野內(nèi)的Bcl-2陽性表達細胞的平均光密度(OD值),OD值越大則表明Bcl-2陽性細胞表達越多。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,滿足正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗;若不滿足正態(tài)分布或方差齊性,采用非參數(shù)秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分

    見表1。假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠在不同時間點均表現(xiàn)出明顯的肢體神經(jīng)缺損癥狀(P<0.01)。與模型組比較,柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠在不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分均有顯著下降(P<0.05),柔肝通絡(luò)湯中、低劑量組不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分有所下降,在再灌注3 h時差異明顯(P<0.05)。柔肝通絡(luò)湯各劑量組間比較,同一時間點,神經(jīng)功能缺損程度評分隨柔肝通絡(luò)湯劑量的降低而逐漸升高,柔肝通絡(luò)湯高劑量組評分最低,柔肝通絡(luò)湯低劑量組評分最高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組與柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組的神經(jīng)功能缺損程度評分在腦缺血再灌注3 h時最低,12 h時上升,24 h時最高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組大鼠不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分比較(分,±s)

    表1 各組大鼠不同時間點的神經(jīng)功能缺損程度評分比較(分,±s)

    注:與模型組同時期比較,*P<0.05,**P<0.01;與假手術(shù)組同時期比較,#P<0.05。下同。

    組別假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯高劑量組柔肝通絡(luò)湯中劑量組柔肝通絡(luò)湯低劑量組n 6 6 6 6 6再灌注3 h 0 2.00±0.63#1.17±0.43*1.33±0.52*1.33±0.63*再灌注12 h 0 2.33±0.52#1.50±0.55*1.88±0.25 2.00±0.41再灌注24 h 0 2.80±0.41#2.00±0.63*2.33±0.52 2.42±0.55

    2.2 各組大鼠梗死側(cè)腦組織觀察

    圖1 各組大鼠不同時間點海馬區(qū)腦組織觀察(HE染色,400倍)

    見圖1。假手術(shù)組:正常細胞層次明了,結(jié)構(gòu)完好,細胞胞漿和胞核染色均勻,細胞核位于中間位置,核仁清晰可見。模型組:較假手術(shù)組而言,正常細胞數(shù)量減少,神經(jīng)元變性、壞死加重,細胞形態(tài)各異,胞體變小,胞核固縮深染,核仁不易見;細胞間隙擴大,大量空泡樣改變,血管擴張充血明顯。細胞損傷程度以再灌注3 h時為輕,隨著時間的推移,細胞損傷逐步加重,在24 h時最為嚴(yán)重。較模型組相比,柔肝通絡(luò)湯各組的神經(jīng)細胞損傷情況得以減輕,其中柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠的神經(jīng)元細胞形態(tài)較為完整,正常細胞數(shù)量較多,細胞固縮程度較輕,仍能清晰區(qū)分胞膜和核仁,細胞空泡樣改變較少。而柔肝通絡(luò)湯中、低劑量組大鼠腦組織損傷程度較柔肝通絡(luò)湯高劑量組有所加重,以柔肝通絡(luò)湯低劑量組最為嚴(yán)重。柔肝通絡(luò)湯各劑量組大鼠在再灌注3 h時細胞損傷程度最輕,隨著時間的推移,神經(jīng)元細胞變性、壞死逐漸加重,24 h時最為嚴(yán)重。

    2.3 各組大鼠梗死側(cè)腦組織Bcl-2陽性細胞表達比較

    見表2。假手術(shù)組大鼠梗死側(cè)海馬區(qū)的Bcl-2表達最少,而模型組和柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組均有Bcl-2蛋白的散在分布。模型組的Bcl-2蛋白表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。與模型組比較,柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組Bcl-2蛋白在各時間點的表達均顯著增高(P<0.01),且隨柔肝通絡(luò)湯劑量的增加而增加,柔肝通絡(luò)湯高劑量組中Bcl-2表達最高,柔肝通絡(luò)湯低劑量組中Bcl-2表達最低。缺血再灌注3 h時,各組大鼠的Bcl-2表達最少,隨著時間的推移,12 h時有所增加,24 h時達到最高值,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 各組大鼠不同時間點的Bcl-2陽性細胞表達比較(OD值,±s)

    表2 各組大鼠不同時間點的Bcl-2陽性細胞表達比較(OD值,±s)

    組別假手術(shù)組模型組柔肝通絡(luò)湯高劑量組柔肝通絡(luò)湯中劑量組柔肝通絡(luò)湯低劑量組n 6 6 6 6 6再灌注3 h-0.036±0.010#0.111±0.004**0.102±0.005**0.070±0.007**再灌注12 h 0.008±0.004 0.054±0.010#0.126±0.006**0.111±0.006**0.090±0.006**再灌注24 h-0.082±0.006#0.127±0.007**0.117±0.004**0.103±0.006**

    3 討論

    腦缺血再灌注損傷的機制與能量代謝失衡、興奮性毒性、炎癥因子釋放、自由基損傷、細胞內(nèi)Ca2+超載、凋亡相關(guān)基因激活等因素有關(guān)[4-6],這些病理過程又相互作用、互為因果,最終造成細胞死亡[7]。例如,腦組織缺血缺氧后,生成過量的氧自由基,直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡;能量代謝失衡和鈣離子超載都可由線粒體損傷引起,而這些又會促進細胞的凋亡;缺血缺氧可能激活凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3等)的表達,進而影響凋亡機制的進展。研究表明,Bcl-2蛋白作為至關(guān)重要的抗凋亡蛋白,可影響腦缺血再灌注損傷后部分神經(jīng)細胞的存活[8],它的特點是其三維空間結(jié)構(gòu)所形成的疏水凹槽除了能結(jié)合含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白影響細胞凋亡外,還能通過多種機制調(diào)控氧化應(yīng)激,從其他途徑誘導(dǎo)細胞凋亡;此外,定位于神經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定狀態(tài),促進鈣離子的快速釋放,從而誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。但又有實驗研究表明[10],在缺血再灌注損傷的早期治療階段,有效運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、病毒載體、針灸療法和神經(jīng)保護制劑等積極的治療方法,可以提高Bcl-2蛋白的表達,從而抑制凋亡的活化,促進腦組織神經(jīng)元修復(fù)。近年來,關(guān)于中醫(yī)藥抑制細胞凋亡的研究日益增多,如銀杏葉提取物[11]對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用,其機制可能與提高腦組織中Bcl-2的表達,降低腦組織中Bax的表達有關(guān);燈盞花素[12]對腦缺血再灌注損傷后的細胞凋亡起到了抑制作用,其減輕腦損傷的作用可能與增加c-Bcl-2表達,減少c-fos和Caspase3的表達有關(guān);丹參[13]對腦缺血后腦組織具有神經(jīng)保護作用,其機制可能與減少腦缺血后ICE的表達,增加Bcl-2的表達有關(guān);補陽還五湯[14-15]能顯著減少缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡,減少腦梗死面積,其影響因素可能與增加Bcl-2/Bax比值有關(guān)。

    本實驗研究結(jié)果顯示,模型組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺損程度評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),且神經(jīng)元細胞損傷更為明顯,其損傷程度隨時間的推移而持續(xù)加重。柔肝通絡(luò)湯各劑量組大鼠的神經(jīng)功能缺損程度評分明顯低于模型組(P<0.05),均能明顯減輕神經(jīng)元細胞損傷,其改善程度呈劑量依賴關(guān)系,其中柔肝通絡(luò)湯高劑量的治療效果最明顯,說明柔肝通絡(luò)湯能有效緩解大鼠腦缺血再灌注腦損傷,降低肢體神經(jīng)功能缺損程度。在Bcl-2蛋白表達方面,模型組高于假手術(shù)組(P<0.01),其中再灌注3 h時Bcl-2蛋白表達較少,且Bcl-2蛋白表達隨時間的推移持續(xù)增加,24 h時達到最高,說明腦缺血再灌注損傷可持續(xù)激活抗凋亡基因Bcl-2蛋白。柔肝通絡(luò)湯高、中、低劑量組與模型組相比,各時間點的Bcl-2表達均明顯升高(P<0.01),且隨著柔肝通絡(luò)湯劑量的增加而增加,說明不同劑量的柔肝通絡(luò)湯均能上調(diào)Bcl-2蛋白的表達。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性腦卒中的病位在腦髓血脈,而腦髓因腎而生,髓海之病,其本源在腎,當(dāng)以補腎為主;乙癸同源,精血互生,陰血虧虛首責(zé)為肝腎虧虛;髓海血脈為病,脈絡(luò)不暢,氣血停滯,瘀血內(nèi)生,而腦髓不得濡養(yǎng),故其病機關(guān)鍵為陰虛血瘀,因此治療缺血性中風(fēng)應(yīng)當(dāng)以養(yǎng)肝補腎為主,兼以活血通絡(luò)。柔肝通絡(luò)湯方中以桑椹子為君,入心、肝、腎經(jīng),滋陰補血;制首烏補益精血,枸杞子滋補肝腎,共為臣藥,助君補肝腎之陰;赤芍、丹參、當(dāng)歸尾等皆入肝經(jīng)而活血散瘀力強,葛根味辛能行以助活血化瘀,地龍善走竄可通經(jīng)活絡(luò),山楂通行氣血,和胃助運,共為佐藥。臨床應(yīng)用[16]已證明柔肝通絡(luò)湯能有效改善患者神經(jīng)功能缺損,縮短康復(fù)時間,提高臨床療效。本課題組前期基礎(chǔ)研究[17-18]也證實本方能降低MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分,縮減腦梗死面積,降低凋亡細胞數(shù),增加活神經(jīng)元數(shù)。本研究提示柔肝通絡(luò)湯能使腦缺血再灌注損傷后大鼠Bcl-2蛋白表達明顯升高,神經(jīng)功能缺損程度評分明顯降低,腦組織神經(jīng)細胞損傷明顯減輕,說明該方具有腦神經(jīng)保護的作用。然而,由于Bcl-2蛋白生物學(xué)特性的復(fù)雜性和參與機制的多樣性,柔肝通絡(luò)湯對抗凋亡蛋白Bc1-2的調(diào)控作用及其信號傳導(dǎo)途徑尚待進一步研究。

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