電針“百會”、“腎俞”改善APP/PS1 小鼠認知障礙的作用及機制探究

陳子奇，孫治琪，黃渤皓，趙凡瑩，劉子旺

（1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100029）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）早期出現(xiàn)記憶力下降，隨著病情進展，認知困難逐漸加重，后期可能出現(xiàn)行為障礙、幻覺等嚴重癥狀，最終喪失基本生活能力［1］。國內(nèi)外研究證實β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉淀是AD 起病及進展的的重要原因［2，3］，而Wnt/β- catenin 信號通路的傳導受阻與Aβ 的聚集所致的神經(jīng)毒性 有很大關系［4，5］。Wnt/β-catenin 通路主要由β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等關鍵蛋白構成［6］。其中β-catenin 是該信號通路的重要下游因子，負責將信號傳遞到細胞中，在通路的激活過程中起著關鍵作用，而GSK-3β則是促進β-catenin 磷酸化、加速其水解的關鍵蛋白，主要與通路的抑制相關［7］。大量實驗證實Wnt/β-catenin 信號通路激活能夠降低Aβ 沉積，進而緩解神經(jīng)元損傷［8，9］。電針作為一種將針身固定在相應穴位上并結(jié)合不同頻率的電流刺激以達到治療效果的新型針刺方法，能夠延緩神經(jīng)元衰老，更加安全有效的抑制AD 的發(fā)展，提高患者或模型鼠的記憶能力［10，11］。但電針對于海馬區(qū)Aβ 沉積的影響以及相關的作用機制尚不明確。因此，本實驗通過觀察電針刺激百會、腎俞穴對小鼠認知功能的作用及其腦組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin 蛋白表達的影響，進而深入探究電針改善AD 的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供24 只4 月齡，雄性，體重（30±5）g 的APP/PS1 癡呆小鼠和8 只4 月齡，雄性，體重（30±5）g 的C57BL/6 小鼠，動物許可證號：SCXK（京）2015-0001。小鼠在實驗前一周統(tǒng)一購入，在溫度（22±2）℃、濕度（55±5）%以及光照明暗各12 h 的環(huán)境中，用標準飼料和自來水適應性喂養(yǎng)一周。使用隨機數(shù)字表法將24 只APP/PS1 小鼠分為3 組：模型組、電針組、西藥組，另設同齡C57BL/6J 小鼠為空白組（8只）。已通過北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：BUCM-4-2019-092402-3070），符合動物倫理委員會的要求，并在實驗過程中嚴格善待動物。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司）；無水乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）；蘇木素染色液（貝索細胞科學技術有限公司）；伊紅染色液（索萊寶科技有限公司）；Anti-GSK-3β antibody（proteintech，中國）；Anti-β-catenin antibody（proteintech，中國）；Anti-GAPDH antibody（abcam，美國）。

華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)）；Morris 水迷宮實驗裝置，離心機（北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院提供）；華佗電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機（Leica Biosystems 公司，德國，型號：RM2255）；研究型顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：DP72），酶標儀（Bio-tek，美國）等。

1.3 干預方法

空白組和模型組：只取穴，不予以針刺，同時給予2 mL 生理鹽水灌胃，每天1 次，共計21 d。

電針組：據(jù)《實驗針灸學》定位百會穴及腎俞穴，先后針刺百會穴（平刺2 mm）、雙側(cè)腎俞穴（直刺1 mm），連接電針儀，設置頻率2 Hz，電流1～2 mA，每次針刺時間為15 min，每日1 次，共計21 d。

西 藥 組：選 擇 鹽 酸 多 奈 哌 齊2 mg·kg-1·d-1）灌胃，每天1 次，共計21 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 Morris 水迷宮測試記憶力和學習能力 Morris 水迷宮法用來評估小鼠的學習能力和記憶力，其主要由兩部分組成：第一部分為定位航行實驗，第二部分為空間探索實驗。該實驗總共歷時5 d，首先在第1 象限水下1 cm 處放置平臺。連續(xù)進行4 d 的定位航行訓練，將小鼠隨機從其余3 個象限放入水池中，重復此訓練并跟蹤小鼠的游泳路線，記錄它發(fā)現(xiàn)平臺的時間（即逃避潛伏期）。在定位航行試驗完成24 h 后，將水底平臺拆除，并將小鼠從原來平臺象限的對側(cè)（即第3 象限）面向池壁放到水下，期間觀察并記錄小鼠60 s 內(nèi)跨越平臺的次數(shù)和其在目標象限停留的時間。

1.4.2 HE 染色觀察小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構 行為學檢測結(jié)束后立即將小鼠麻醉，斷頭取腦，在冰盤上取出腦組織，對樣本進行預冷、固定、洗滌、脫水、埋蠟等處理，制作厚度為5 μm 的樣本切片。隨后對切片脫蠟處理，再用無水乙醇充分水化，清洗，用蘇木素染色，5 min 后沖洗再浸入伊紅染色液，再次清洗后封片在×200 倍鏡下對小鼠腦組織的形態(tài)結(jié)構變化進行觀察。

1.4.3 Western Blot 法檢測小鼠腦組織內(nèi)GSK-3β、β-catenin 蛋白含量 取出剩余的50 mg 海馬組織，加入RIPA 裂解液進行勻漿、裂解、離心處理，按照BCA 法測定樣品蛋白的含量，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h。加入一抗（GSK-3β 1∶1 000、β-catenin 1∶1 000），4 ℃搖動作用過夜；TBST 溶液中搖動漂洗，加入二抗（羊抗兔IgG 抗體 1∶1 000），室溫孵育1.5 h 后漂洗，進行顯色、成像處理，并分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果采用均數(shù)±標準誤（±s）表示，組間比較采用單因素ANOVA 檢驗。若P＜0.05，則提示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對小鼠空間學習及記憶能力的影響

在前4 d 的定位航行實驗中，第1 天是小鼠的適應性培養(yǎng)。與空白組比，模型組小鼠在訓練期間的逃避潛伏期時間顯著增加，提示APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠存在明顯的認知能力下降；從第2 天起，電針組和西藥組逃避潛伏期的時間均低于模型組（P＜0.05），且隨著訓練天數(shù)增加均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。從游泳軌跡圖來看，與模型組相比，各治療組小鼠軌跡總路程均變短、目的性增強。見表1及圖1）。

圖1 干預后小鼠定位航行實驗游泳軌跡圖Fig 1 The swimming track map of mice was located in navigation experiment after the intervention

表1 干預后小鼠逃避潛伏期的變化（n=8，s，±s）Tab 1 Mice escaped the change of incubation period after intervention（n=8，s，±s）

表1 干預后小鼠逃避潛伏期的變化（n=8，s，±s）Tab 1 Mice escaped the change of incubation period after intervention（n=8，s，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05。

組別空白組模型組電針組西藥組4 d 24.75±4.87 52.94±5.48*30.03±15.78*#31.59±47.15*#35.726＜0.001FP2 d 39.35±5.58 56.44±14.19*43.25±7.42*#47.51±46.40*#12.009＜0.001 3 d 31.88±4.82 51.03±16.33*39.22±6.11*#41.09±46.42*#14.064＜0.001

在第5 天的空間探索試驗中，與空白組比，模型組小鼠的目標象限停留時間顯著縮短、穿越平臺次數(shù)顯著減少，提示APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠存在記憶障礙；與模型組比較，電針組和西藥組的目標象限停留時間明顯延長、穿越平臺次數(shù)增多（P＜0.05）。從游泳軌跡圖來看，與模型組相比，各治療組小鼠多在原平臺位置及附近處游動，目的性較大，目標象限內(nèi)軌跡較為密集。見表2 及圖2）。

圖2 干預后小鼠空間探索實驗游泳軌跡圖Fig 2 Swimming trajectories of mice in space exploration experiment after intervention

表2 小鼠干預后目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)的變化（±s）Tab 2 Changes of residence time in the target quadrant and times of crossing the platform in mice after intervention（±s）

表2 小鼠干預后目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)的變化（±s）Tab 2 Changes of residence time in the target quadrant and times of crossing the platform in mice after intervention（±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05。

穿越平臺次數(shù)（次)5.50+0.93 2.00±1.07*4.00±1.07*#3.75±1.04*#15.621＜0.001組別空白組模型組電針組西藥組FP目標象限停留時間(s)27.63±3.45 12.28±5.28*21.28±4.67*#20.19±7.78*#10.394＜0.001

2.2 電針對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構的影響

小鼠海馬HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠的神經(jīng)元分布均勻整齊，細胞結(jié)構完整清晰。模型組小鼠神經(jīng)細胞分布紊亂不均勻，細胞核明顯縮小，細胞間隙明顯存在；與模型組相比，電針組和西藥組可見小鼠神經(jīng)元形態(tài)基本接近正常，結(jié)構較清晰。見圖3。

圖3 各組小鼠干預后海馬組織病理形態(tài)（HE 染色）Fig 3 Hippocampal histological morphology of mice in each group after intervention（HE staining）

2.3 電 針 對 小 鼠 腦 組 織 內(nèi)GSK-3β、β-catenin 的影響

與空白組相比，模型組小鼠中的β-catenin 蛋白水平減少（P＜0.01），GSK-3β 蛋白水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，電針組、西藥組中的β-catenin蛋白表達顯著上升（P＜0.01），GSK-3β 蛋白表達顯著下降（P＜0.01）。見圖4。

圖4 小鼠海馬β-catenin、GSK-3β 蛋白表達比較Fig 4 Comparison of β-catenin and GSK-3β protein expression in mouse hippocampus

3 討論

Aβ 沉積是AD 的重要病因，其沉積所產(chǎn)生的老年斑也是AD 的主要病理變化。Aβ 是由于淀粉樣前體蛋白在β 分泌酶和γ 分泌酶作用下水解而形成的一種蛋白，其難以溶解，易在突觸間隙內(nèi)大量聚集而導致老年斑的形成，老年斑一旦形成則會募集大量小膠質(zhì)細胞而產(chǎn)生神經(jīng)毒性［12］。正常情況下Aβ 始終保持一種動態(tài)的平衡，當Wnt/β-catenin 通路阻斷則會導致Aβ 失衡而大量沉積，沉積的Aβ 會通過促進炎癥反應、誘導細胞凋亡而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，導致神經(jīng)元損害進而加速AD 的發(fā)展［13，14］。

中醫(yī)認為AD 與“癡呆”、“呆病”屬于同一范疇，其病機復雜，既有心血虧虛、脾氣虛衰、腎精不足等虛邪內(nèi)耗，也有痰濁瘀血等實邪蒙竅，其中腎精不足，髓海虧虛為根本病機。腎為封藏之本，內(nèi)藏腎精，腦髓的生成源于腎精，隨著年齡的增長，腎精逐漸虧損，腦海失充而影響腦的記憶功能，出現(xiàn)記憶力下降、呆傻愚鈍的表現(xiàn)，臨床治療上亦多從補腎益智出發(fā)?！鹅`樞·海論》中記載：“督脈貫脊……入屬于腦”，可見督脈直接溝通了腦絡，并與腎相連，百會穴作為督脈的要穴，位于巔頂，具有益智醒神之效；膀胱經(jīng)與腦相連，入腰中絡腎，可使氣血通暢，陰陽調(diào)和，腎俞位于膀胱經(jīng)，是腎精聚集之處，針刺腎俞能使腎生髓。因此本實驗選取百會、腎俞兩穴位相配充分體現(xiàn)了補腎填精，醒神益智的中醫(yī)整體觀念。

傳統(tǒng)毫針針刺的刺激量決定機體是否得氣，且與療效密切相關，電針將針刺的刺激量量化及標準化，具有較好的治療效果［15］。鹽酸多奈哌齊［16］已被證實能夠緩解AD 的發(fā)展，但其長期口服存在一定副作用，且成本較高，而電針與其相比具有價格低廉，安全性較高的優(yōu)勢，且有研究發(fā)現(xiàn)［17，18］電針能夠通過影響突觸可塑性、降低腦部炎性反應而改善小鼠認知障礙，在臨床上有著良好的應用前景。但對于電針降低Aβ 沉積的研究較少，因此本實驗擬從緩解Aβ 沉積造成的神經(jīng)元損傷角度出發(fā)，探討電針治療AD 的機制。

Wnt/β-catenin 信號途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。Wnt 蛋白作為始動因子與其它蛋白（如 Frizzled）等充分結(jié)合，從而降低GSK-3β 蛋白的活性，使β-catenin 蛋白快速累積，從而調(diào)節(jié)下游目標基因的轉(zhuǎn)錄，最終啟動該信號途徑的傳導［19］。Wnt/β-catenin 信號通路受到抑制已被確認與加速Aβ 沉積相關，其對神經(jīng)系統(tǒng)的損害表現(xiàn)在加重神經(jīng)毒性從而導致嚴重的神經(jīng)元損害［20］。β-catenin 蛋白是Wnt 信號傳導通路主要的正向調(diào)節(jié)因子，其過度磷酸化則不能激活下游基因的表達，進而抑制該通路，從而使Aβ 在腦內(nèi)積聚而形成老年斑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性［21］。GSK-3β 作為決定降解β-Catenin 的重要負向調(diào)節(jié)激酶，其活性增強直接導致β-Catenin 磷酸化速度加快，使其被大量降解，從而阻斷Wnt/β-catenin 信號通路；此外GSK-3β 也會直接參與到β淀粉樣前體蛋白的酶解過程，其活性增強也會加速Aβ 的生成和沉積，反之沉積的Aβ 會造成GSK-3β過表達，從而過度降解β-catenin，進一步阻斷信號通路，加重神經(jīng)元的損傷，促進AD 的進展［5，22］。由此可見，下調(diào)GSK-3β 表達，不僅可以直接加速Aβ 的清除，還可以減少β-catenin 蛋白的過度降解，促進其向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移進而啟動Wnt/β-catenin 信號途徑，降低Aβ 沉淀，減輕神經(jīng)細胞的損傷。

本實驗結(jié)果顯示，電針、西藥處理均能改善小鼠學習記憶功能。且電針干預后的HE 染色結(jié)果也表明小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列基本接近正常，表明電針能夠明顯改善AD 的認知障礙。AD 的病理改變與腦中Aβ 的聚集有關，同時發(fā)現(xiàn)電針干預能夠降低與Aβ 沉積相關的GSK-3β 蛋白，并增加β-catenin蛋白的表達，提示電針對AD 小鼠學習和記憶功能的改善作用可能與 Aβ 聚集的減少有關。

綜上，電針干預可下調(diào)AD 小鼠海馬的GSK-3β表達，并上調(diào)β-catenin 表達，激活Wnt 信號通路，降低Aβ 的沉積，從而減少神經(jīng)元損傷。這為降低患者長期口服藥物存在的副作用以及經(jīng)濟壓力提供了新的輔助治療思路，也為深入研究不同頻率的電針改善小鼠認知障礙的具體機制提供了基礎實驗依據(jù)。

作者貢獻度說明：

陳子奇：實驗設計與實施、數(shù)據(jù)處理與分析、撰寫論文；孫治琪：參與實驗設計與實施；黃渤皓：實驗動物飼養(yǎng)、實驗標本采集；趙凡瑩：數(shù)據(jù)分析技術指導；劉子旺：實驗設計、實驗內(nèi)容統(tǒng)籌與規(guī)劃、技術指導。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。