基于網(wǎng)絡藥理學探討“高良姜-廣藿香”藥防治糖尿病胃輕癱胃排空的作用機制

謝振蕊，李 麗，周明艷，張俊清，2，李海龍，2

（1.海南醫(yī)學院藥學院 海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南 ?？?571101；2.海南醫(yī)學院 藥學院，海南 ?？?71199）

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是一種胃上部、胃竇體、幽門下括約肌和十二指腸無機械梗阻的胃蠕動加速或胃排空障礙的并發(fā)癥，主要以胃平滑肌運動異常、胃排空遲緩、胃電節(jié)律失調的為特點，以早飽、腹脹、嘔吐、上腹痛、血糖控制不良等為表征［1，2］。據(jù)統(tǒng)計，胃輕癱在1 型糖尿病患者的發(fā)病率約5.3%，肥胖2 型糖尿病達1.1%，其中女性患者占比約達4/5，存在性別差異［3-5］。雖然糖尿病胃輕癱是一種嚴重影響患者生活質量的健康問題，但胃輕癱的發(fā)病分子機理尚不清楚。迄今，海內(nèi)外學者對于DGP 的研究認為，機體血糖失調、氧化應激受損、胃腸神經(jīng)異常、Cajal 間質細胞（ICC）丟失等與DGP 的發(fā)病密切相關［6-9］。因此，臨床 上 主 要 采 取 血 糖 維 系［10］、藥 物 治 療［11］、胃 電 刺激［12］、手術治療［13］和飲食控制［14］等方式控制DGP 病情的發(fā)展，其中藥物治療因為相對安全且便捷常常作為首選。然而，常用的西藥多潘立酮、胃復安和西沙必利由于不良反應和快速耐受性而導致使用受限［15，16］。而療效溫和的中藥在多種病癥中的應用潛力巨大，越來越受到重視。

高良姜Alpinia officinarum Hance.為姜科的干燥根莖，具有溫胃止嘔、散寒止痛、脾虛寒瘧，健脾胃等功能與糖尿病性胃輕癱脾胃虛寒（包含脾胃虛弱）的臨床表現(xiàn)及主要證型之一相對應。近年來研究表明，高良姜具有抗胃潰瘍、止嘔、促進胃排空、腸推進、降血糖和胃腸道保護等藥理作用［17-20］。廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.為唇形科植物，具有化濕、解暑、止嘔的作用［21］。據(jù)《本草逢原》描述，廣藿香在開胃止嘔、治腹瀉方面具有很好的療效，且臨床上曾使用藿香正氣軟膠囊治療DGP［22］。從中醫(yī)理論出發(fā)，高良姜溫胃平逆，行氣導滯，廣藿香芳香化濁，和中止嘔，兩者均歸于脾、胃經(jīng)，屬于相使為用，功效協(xié)同、相輔相成，大大增強了益氣健脾和胃之效。但尚沒有任何確切的證據(jù)表明兩者合用能有效地改善DGP 的病程。本研究使用網(wǎng)絡藥理學方法，利用已有數(shù)據(jù)庫，對”高良姜-廣藿香”治療DGP 過程中可能作用的靶點和通路進行大膽預測，為今后的相關研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 高良姜和廣藿香活性化合物及靶點篩選

在 中 藥 藥 理 學 數(shù) 據(jù) 庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中分別以“高良姜”和“廣藿香”為關鍵詞，設置OB≥30%和DL≥0.18 為篩選依據(jù)，獲得高良姜和廣藿香各自的藥效化合物及其相應的靶蛋白。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫，設置篩選物種類別，將靶蛋白轉換整理為相應的靶基因。

1.2 DGP 相關靶點篩選

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）中，以“diabetic gastroparesis”和“delayed gastric emptying”為關鍵詞，以關聯(lián)系數(shù)≥10 為篩選指標，獲得DGP 疾病主要靶基因。

1.3 高良姜-廣藿香治療DGP 潛在靶點預測

將“高良姜-廣藿香”藥主要藥效成分靶點和DGP 相應靶基因導入維恩圖網(wǎng)站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中，得到的重合部分即為“高良姜-廣藿香”藥與DGP 的共同靶基因。

1.4 核心靶點篩選和網(wǎng)絡圖構建

獲得的共同靶基因后導入STRING 軟件平臺，選擇物種“homo sapiens”，最低相互作用評分最高置信度為0.70，其余保持不變，獲得蛋白互作數(shù)據(jù)后導入 Cytoscape 3.8.0 軟件中繪制PPI 網(wǎng)絡圖，并采用CytoNCA 對網(wǎng)絡中基因節(jié)點度值、介數(shù)等進行分析篩選核心靶點。

1.5 GO 與KEGG 通 路 富 集 分 析

下載ClusterProfiler R 功能包對“高良姜-廣藿香”與DGP 的共同靶點進行GO 功能分析和KEGG通路富集。獲得與“高良姜-廣藿香”藥防治DGP 的密切相關生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）及信號通路。

2 結果

2.1 高良姜-廣藿香主要藥效化合物及作用靶基因

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢，得到高良姜主要藥效化合物13 個、廣藿香11 個，去除重復后，共獲得23 個目標成分，其對應靶點97 個。主要藥效化合物信息如下表1 所示。

表1“高良姜-廣藿香”主要化合物信息Tab 1 Information of main active ingredients a of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”

2.2 相關靶點的挖掘及網(wǎng)絡圖構建

2.2.1 高良姜-廣藿香藥治療DGP 靶點的挖掘 從GeneCards 分析平臺中篩選出DGP 相關靶基因533個。將其與“高良姜-廣藿香”活性化合物對應的靶點通過維恩圖找出交集后，得到”高良姜-廣藿香”與DGP 的共同靶點46 個。分別為AKR1B1、AR、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CASP9、CTSD、CAV1、TP63、CRP、CYP3A4、EGFR、ESR1、ESR2、CCND1、CCNB1、GABRA1、GSTM1、GSTP1、GSK3B、HIF1A、IGF2、IGFBP3、IRF1、IL6、NR3C2、MAPK8、MYC、NQO1、NFE2L2、PPARG、PGR、PTGS1、PRKCA、FOS、RAF1、RASSF1、ERBB2、ERBB3、RB1、RUNX2、CHEK2、PON1、PLAU、VEGFA。韋恩圖結果如圖1 所示。

圖1“高良姜-廣藿香”藥物和DGP 相關靶點的韋恩圖Fig 1 Venn Chart of related targets of active constituents of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”and DGP

2.2.2 高良姜-廣藿香治療DGP“藥物-活性-靶點”的構建 將收集的共同靶點excel 數(shù)據(jù)表導入Cytoscape 軟件，構建“藥物-化合物-靶點”間的網(wǎng)絡圖。結果如圖2 所示?！案吡冀?廣藿香”的槲皮素、山柰酚和高良姜素成分的靶點最多，可認為是“高良姜-廣藿香”治療DGP 的主要成分。此外，從圖中可以看出“高良姜-廣藿香”藥的多種成分可以作用于同一個靶點，一種成分可以作用于不同的靶點，充分提示了“高良姜-廣藿香”藥主要通過多成分、多靶點和多通路互作的特點。

圖2“高良姜廣藿香-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖Fig 2 Constituent -target-disease-pathway network of“A.officinarumand Pogostemonis Herba”

2.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡圖構建 將“高良姜-廣藿香”治療DGP 的共同靶點互作數(shù)據(jù)導入Cytoscape 軟件繪圖并經(jīng)CytoNCA 分析后得到網(wǎng)絡圖3 及拓撲節(jié)點參數(shù)表2。由結果可知，EGFR、CCND1、ESR1、FOS、MAPK8 等鄰接節(jié)點最多，可能為核心靶點。

2.3 GO 功能富集和 KEGG 通路富集分析

利用R 語言中ClusterProfiler 插件進行共同靶點的GO 功能分析和KGEE 富集。其中GO 功能富集包括BP 相關條目 87 條，主要涉及對藥物的處置，對凋亡信號的負調節(jié)及對 RNA 酶Ⅱ啟動子轉錄等方面；CC 相關數(shù)目 26 條，位于前列有蛋白磷酸酶結合、細胞因子活性、類固醇結合和轉錄因子活性等；MF 相關數(shù)目12 條，主要涉及核染色質、線粒體外膜、細胞外空間和核染色質等方面。GO 功能富集結果見圖4。

圖3“高良姜-廣藿香”治療 DGP 相關 PPI 網(wǎng)絡Fig 3 PPI network of common genes of active compounds of“A.officinarum-Pogostemonis Herba”and DGP

圖4 高良姜廣藿香治療 DGP 的 GO 功能富集分析圖Fig 4 Analysis diagram of GO function enrichment in treatment of DGP by“A.officinarum-Pogostemonis Herba”

表2“高良姜-廣藿香”治療 DGP 的關鍵靶點信息Tab 2 Key target information of“A.officinarum and Pogostemon cablin”in DGP treatment

“高良姜-廣藿香”藥治療DGP 的46 個共同靶點主要富集在 25 條通路上（P＜0.01），主要包括PI3K-AKT、MAPK、Endocrine resistance、Focal adhesion、EGFR tyrosine kinase、Apoptosis and P53 pathway 等炎癥或凋亡調控途徑。結果見圖5。

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble chart of KEGG critical pathways with enrichment

3 討論

糖尿病胃輕癱系指由胃腸動力障礙引起的胃排空遲緩或胃蠕動加快的臨床綜合征。胃排空主要是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調控下，由平滑肌、自主神經(jīng)系統(tǒng)和特殊的起搏細胞（Cajal 間質細胞）協(xié)調完成的，任何一個過程破壞均有可能影響胃排空機制［23，24］。研究提示，在胰島素抵抗或胰島素信號傳導障礙的患者體內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)ICC 細胞數(shù)量的減少及形態(tài)功能的發(fā)生改變，這在DGP 病程中具有重要的影響［25］。此外，高血糖可導致機體一直處于高氧化應激和高炎癥狀態(tài)，正常的抵抗氧化應激機制受損，核轉錄調控因子Nrf2 及下游抗氧化基因表達降低，nNOS 介導的胃氮松弛受到抑制，Cajal 間質細胞丟失，胃竇動力變差，胃節(jié)律失常，加速DGP 發(fā)展進程［26-28］。而調控抗氧化通路可以上調HO-1 和Nrf2 的表達，不僅可以保護ICC 細胞免受損害，而且通過維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)以及恢復改變的胃nNOS 功能可使胃排空延遲恢復正常，阻礙DGP 發(fā)展［28］。

通過對中藥數(shù)據(jù)庫的搜索整理，獲得”高良姜-廣藿香”藥對應活性化合物共有97 個靶蛋白，對與DGP 關鍵靶點有46 個。其中槲皮素、山柰酚和高良姜素等化合物的潛在作用靶點最多。在對高良姜的研究中，程守前等［29，30］發(fā)現(xiàn)高良姜提取物能明顯降低STZ 與高脂高糖聯(lián)合誘導的T2DM 大鼠及dbdb 小鼠的空腹血糖，減輕T2DM 誘導的胰腺及肝臟功能的損傷；Thrush 等［31］研究提示，槲皮素能夠抑制TNF-α 和iNOS 表達水平的上調，恢復棕櫚酸鹽處理的L6 肌管葡萄糖攝取的降低；Kim 等［32］進一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠減少高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠骨骼肌中巨噬細胞的積累和炎癥因子（如TNF-α 和MCP-1）的 水 平，以 及MAFbx/atrogin1 和MuRF1 mRNA 的表達，而胰島素抵抗與肥胖患者骨骼肌炎癥及萎縮密切相關，提示槲皮素可以通過抑制骨骼肌炎癥介質和巨噬細胞浸潤來保護肥胖相關的骨骼肌萎縮，從而改善胰島素抵抗，降低機體血糖。Hana 等人［33］發(fā)現(xiàn)口服山奈酚可以通過抑制丙酮酸羧化酶（PC）和G6Pase 表達活性抑制肝糖異生及增加Akt 和GCK（葡萄糖激酶）的活性來改善肝臟葡萄糖代謝，緩解高脂高糖飲食誘導的肥胖小鼠的空腹高血糖、葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗；張茁等［34］通 過 建 立 自 發(fā) 性2 型 糖 尿 病KKAY 小 鼠 動 物模型提示，山柰酚可能通過介導骨骼肌PI3K-AKT-GLUT4 信號途徑，緩解小鼠血糖耐受及體重，改善胰島素抵抗；Abukhalil 等［35］在高良姜素對糖尿病大鼠的心臟保護作用發(fā)現(xiàn)，高良姜素能夠改善糖尿病大鼠的高血糖、血脂異常和心功能指標，阻止組織病理學改變。故而，結合相關研究及此次結果預測，“高良姜-廣藿香”藥治療 DGP 胃排空異常的可能與“高良姜-廣藿香”藥通過降低機體血糖、改善胰島素敏感性、調節(jié)氧化應激和炎癥反應等有關。

利用R 語言預測KEGG 通路，發(fā)現(xiàn)“高良姜-廣藿 香”藥 主 要 可 能 通 過PI3K/Akt、MAPK、p53、ErbB、HIF-1 和IL-17 等 途 徑 發(fā) 揮 對DGP 的 作 用。其中，PI3K/AKT 通路在張默函等［36］進行的胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞凋亡研究中，被發(fā)現(xiàn)PI3K 及P-AKT 的表達會隨著機體高血糖的持續(xù)刺激呈先增高后下降至正常標準以下的現(xiàn)象，胃平滑肌細胞也從剛開始受到刺激時的自我保護狀態(tài)轉化到抗凋亡功能消失；此外，PI3K/AKT 通路在高良姜素抗H2O2誘導的氧化損傷研究中，被證實能夠被H2O2抑制，導致Bcl-2/Bax 比值降低，誘導細胞凋亡［37］。而張鋒利等［38］在桔梗枳殼湯加味的實驗結果中表示，激 活PI3K/AKT 通 路，增 加p-PI3K 與p-Akt 的表達水平，能夠影響胃腸激素，調控胃腸動力，這對DGP 的 發(fā) 展 具 有 重 要 的 作 用；Barros 等［40-42］研 究 人員發(fā)現(xiàn)p38/MAPK 通路在高血糖或糖尿病患者中，能夠誘導促炎癥介質如iNOS、TNF-a 和IL-1β 的產(chǎn)生，影響胃腸道蠕動障礙，造成糖尿病大鼠胃排空機制障礙；Thomas 等［43］在科學研究中發(fā)現(xiàn)，激活p38/MAPK 通路，可以加快雌激素受體（ER）的轉運速度，促使ER 與雌激素反應元件（EREs）結合加快，而在嚙齒動物和人類中發(fā)現(xiàn)，雌激素對胃排空有重要的作用。這些數(shù)據(jù)表明，MAPK 通路在胃排空遲緩的發(fā)病機制中起著重要作用，被認為是治療炎癥性胃排空障礙的理想靶點。P53 是一種腫瘤抑制蛋白，可調節(jié)細胞周期調節(jié)、氧化還原穩(wěn)態(tài)、DNA復制與修復、凋亡與自噬、能量代謝等多種維持穩(wěn)態(tài) 的 基 因 表 達［44，45］。Zhang 等［46，47］在AMPK 介 導 高糖條件下大鼠胃平滑肌細胞凋亡的機制研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 激活觸發(fā)p53 蛋白活化，誘導促凋亡BAX 因子的表達，抑制Bcl-2 的mRNA 轉錄，可以影響胃平滑肌細胞凋亡進程，損害胃腸運動機制。

結合以上分析預測結果及相關研究數(shù)據(jù)，推測”高良姜-廣藿香”藥防治DGP 主要是通過作用于多個因子及信號通路來發(fā)揮作用，為后期“高良姜-廣藿香”藥治療DGP 研究提供參考。

作者貢獻程度說明：

謝振蕊：提出研究思路、設計研究方案、論文撰寫；李麗：數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)、論文起草；周明艷：負責數(shù)據(jù)整理、圖片繪制、論文起草；張俊清：提供研究經(jīng)費、對論文進行修改指正；李海龍：提供指導論文撰寫、對論文進行修改指正。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。