趕黃草總黃酮對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致小鼠急性藥物性肝損傷的保護(hù)作用

付滿玲，姚淮育，侯筱芳，九 紅，袁葉飛

1.西南醫(yī)科大學(xué)科技處公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（瀘州646000）；3.瀘州市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（瀘州 646000）

藥物的代謝主要在肝臟中進(jìn)行，但伴隨藥物濫用情況的增加，藥物性肝損傷的出現(xiàn)與發(fā)展也逐步增加[1]。對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是鎮(zhèn)痛解熱藥，應(yīng)用廣泛[2]。在我國(guó)由于超過(guò)安全劑量服用APAP所致藥物性肝損傷的發(fā)生是常見(jiàn)的醫(yī)療衛(wèi)生、健康安全問(wèn)題[3]。

趕黃草（Penthorum chinense Pursh）是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜的干燥地上部分。歸肝經(jīng)，微辛、性平、味苦、無(wú)毒，用于治療黃疸、水腫等癥。在苗族民間針對(duì)肝病的預(yù)防和治療已有上千年的食用史和用藥史[4]，安全無(wú)毒，療效獨(dú)特，認(rèn)可度高，被譽(yù)為“神仙草”[5]。

肝損傷是各種各類肝病所共同表現(xiàn)出來(lái)的一種病理狀態(tài)。多項(xiàng)研究表明，趕黃草對(duì)其有預(yù)防和保護(hù)作用［6-8］。通過(guò)分析，黃酮類化合物含量高、是其主要成分[9-11]，總黃酮是其主要功效成分[12]。項(xiàng)目組通過(guò)前期研究，萃取了趕黃草總黃酮（純度＞50%，以喬松素計(jì)），主要由喬松素、異槲皮苷、山奈酚、槲皮素和芹菜素構(gòu)成[12]，且有報(bào)道其為保護(hù)藥物性肝損傷的成分[13-16]。

APAP常用于誘導(dǎo)藥物性肝損傷，是便捷、有效、易復(fù)制的方法[17]。本研究用APAP 制備小鼠急性藥物性肝損傷模型，探究趕黃草總黃酮對(duì)其保護(hù)作用及可能機(jī)制，為利用趕黃草總黃酮開(kāi)發(fā)防治藥物性肝損傷的藥物和保健食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

昆明小鼠（體重20±2g），SPF 級(jí)，雄性，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17]，飼養(yǎng)溫度18℃～22 ℃，濕度50%～60%，本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：20200727）。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 趕黃草，來(lái)源于四川省瀘州市古藺縣，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)中藥資源與鑒定研究教研室稅丕先教授鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草（Penthorum chinese Pursh）干燥全草；本實(shí)驗(yàn)中使用的趕黃草總黃酮，是項(xiàng)目組在前期研究中自制而得，純度為50.34%（以喬松素計(jì)），主要由喬松素、異槲皮苷、山奈酚、槲皮素和芹菜素組成，HPLC 指紋圖譜見(jiàn)項(xiàng)目組前期研究[18]，制備方法為將趕黃草用含水乙醇加熱回流得到提取物，然后將其放入聚酰胺柱色譜柱制得純化物，批號(hào)為20 200621；對(duì)乙酰氨基酚片（0.5 g），購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)為016 191002；聯(lián)苯雙酯，購(gòu)自萬(wàn)邦德制藥有限公司，批號(hào)為19j 200607；谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒，購(gòu)自邁克生物股份有限公司，批號(hào)分別為1219051、0120051、0120091、0 720091；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為EK282/3-96、EK206/3-96；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物，批號(hào)分別為A003-1、A001-3；4%多聚甲醛，購(gòu)自中國(guó)Biosharp-白鯊公司，批號(hào)為70081800。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 7180型全自動(dòng)生化分析儀，日立（HITACHI）公司；mini spin 離心機(jī)，中國(guó)Eppendorf 公司；TD-5Z 離心機(jī)，蜀科公司；TECAN 酶標(biāo)儀，奧地利Sunrise公司；移液器，中國(guó)Enppendof公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、給藥及處理 本課題組前期實(shí)驗(yàn)已檢測(cè)出小鼠對(duì)趕黃草總黃酮的最大耐受量為33.6 g/kg[19]。雖已確定趕黃草為無(wú)毒性的藥食兩用植物，但因其成分復(fù)雜，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況采用了人與動(dòng)物等效劑量法，設(shè)立高、低兩個(gè)劑量組，其劑量通常設(shè)為2:1，則本研究采用人與動(dòng)物等效劑量法確定了趕黃草總黃酮高、低劑量?jī)蓚€(gè)分組，劑量設(shè)置分別為800 mg/kg和400 mg/kg。

適應(yīng)性喂養(yǎng)50只雄性KM小鼠1周后，將其隨機(jī)分為5組，每10只一組，分別為A組（正常組）、B組（模型組）、C組（陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯組，150 mg/kg）、D組（趕黃草總黃酮高劑量組，800 mg/kg）和E 組（趕黃草總黃酮低劑量組，400 mg/kg），各組按以上給藥方案均每日灌胃（ig）給藥，其中A 組及B 組均ig 等體積的蒸餾水（0.2 mL/10g），1 次/d，連續(xù)14 d，實(shí)驗(yàn)期間自由活動(dòng)和飲食飲水。在末次ig 對(duì)應(yīng)藥物1 h 后，除了A 組腹腔注射（ip）等體積蒸餾水外，其余各組均ip 對(duì)乙酰氨基酚溶液（APAP 300 mg/kg）造模，然后所有組別禁飲食不禁水，期間觀察其活動(dòng)情況，經(jīng)過(guò)16 h后，小鼠眼球取血，將取得的血液標(biāo)本于4 ℃環(huán)境中靜置1 h后，離心分離血清（3 000 r/min，10 min），小鼠脫臼處死后，及時(shí)解剖小鼠采集其肝臟，稱量取得的肝臟組織重量并計(jì)算肝臟系數(shù)（計(jì)算公式如下），然后將肝臟組織分出一部分于-80 ℃中凍存?zhèn)溆靡赃M(jìn)行ELISA指標(biāo)檢測(cè)，另外的一部分組織使用固定液（4%多聚甲醛）進(jìn)行固定以制作組織切片進(jìn)行病理觀察。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 取5 組小鼠靜置離心后血清上清液，按照試劑盒相關(guān)操作說(shuō)明對(duì)ALT、AST、LDH 和ALP 進(jìn)行檢測(cè)，采用7180 全自動(dòng)生化儀來(lái)測(cè)定血清的生化酶指標(biāo)水平；與此同時(shí)，取5 組的肝臟組織，冰浴制備10%肝組織勻漿（按照1:9的比例來(lái)進(jìn)行制備），取制備好的上清液，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，測(cè)定TNF-α、IL-6、SOD和MDA含量。

1.3.3 小鼠肝組織病理切片的制作與觀察 將置于固定液中的肝臟取出，使用石蠟包埋好，然后完整、均勻切片（厚度約4 μm），用HE染色法，將以上制備好的肝組織切片置于光學(xué)顯微鏡下，觀察對(duì)比記錄相關(guān)病理學(xué)改變，比較分析5 組小鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)的改變和相關(guān)損傷情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 趕黃草總黃酮對(duì)肝臟系數(shù)的影響

動(dòng)物的肝臟系數(shù)在正常情況下是比較穩(wěn)定；但是動(dòng)物肝臟損傷后，其肝臟系數(shù)會(huì)出現(xiàn)變化。動(dòng)物肝臟系數(shù)的升高表明了肝臟有水腫、充血或增生肥大等異常情況的發(fā)生。B 組（模型組）較A 組（正常組）肝臟系數(shù)升高了11.60%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），表明了本研究中B組的小鼠肝臟存在充血、水腫等情況；D 組和E 組的肝臟系數(shù)相較于B 組分別降低了7.65%和7.06%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 趕黃草總黃酮對(duì)肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 1 Effect of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient（，n=10）

表1 趕黃草總黃酮對(duì)肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 1 Effect of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on liver coefficient（，n=10）

注：A組為正常組，B組為模型組，C組為陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯組，D組為趕黃草總黃酮高劑量組，E組為趕黃草總黃酮低劑量組；與空白組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05

2.2 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP和LDH水平的影響

肝臟功能變化時(shí)，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性的升高表示肝細(xì)胞膜受到了損傷，兩數(shù)值的高低可從一定程度反映肝臟受到損傷的程度，并且是早期反映出變化的敏感性指標(biāo)，而AST 升高則表示了損傷達(dá)到了細(xì)胞器[20]。堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）兩個(gè)指標(biāo)的升高可從一定程度上體現(xiàn)或反映小鼠的肝細(xì)胞受損傷程度和情況，在臨床中也是常用于肝臟疾病診斷的指標(biāo)[21]。B組（模型組）的ALT、AST、ALP 和LDH 與A 組相比均顯著升高（P ＜0.01），表明了APAP導(dǎo)致了肝細(xì)胞膜受損，肝臟功能受到了損傷；而D 組和E 組的ALT、AST、ALP、LDH 相較B 組降低了，具有顯著的差異（P ＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響（，n=10）Table 2 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum liver function indexes in mice（，n=10）

表2 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響（，n=10）Table 2 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on serum liver function indexes in mice（，n=10）

注：與空白組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01

2.3 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠肝組織TNF-α、IL-6 水平影響

腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的釋放和浸潤(rùn)會(huì)促使細(xì)胞凋亡，引發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，表現(xiàn)出不同程度危害，對(duì)機(jī)體正常的生理過(guò)程造成影響，甚至導(dǎo)致肝損傷[22]。與A組比較，B組的TNF-α水平和IL-6水平顯著升高（P ＜0.01）；與B組比較，D組的TNF-α和IL-6水平顯著降低（P ＜0.01，P ＜0.05），E組TNF-α水平相較于B組顯著降低（P ＜0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 趕黃草總黃酮對(duì)TNF-α、IL-6水平影響（，n=10）Table 3 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on TNF-α and IL-6 levels（，n=10）

表3 趕黃草總黃酮對(duì)TNF-α、IL-6水平影響（，n=10）Table 3 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on TNF-α and IL-6 levels（，n=10）

注：與空白組比較，aP ＜0.01；與模型組比較bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.4 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠肝組織SOD、MDA水平影響

與A 組比較，B 組的肝組織SOD 含量顯著降低（P ＜0.01），MDA 水平顯著升高（P ＜0.01），表明使用APAP 造模后，小鼠肝組織受到了損傷，導(dǎo)致抗氧化的超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，以及過(guò)氧化終產(chǎn)物的丙二醛（MDA）活性增加，機(jī)體失去正常調(diào)節(jié)氧化平衡能力，清除自由基能力下降。與B 組比較，D 組和E組的SOD 活性升高，MDA 水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01，P ＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 趕黃草總黃酮對(duì)SOD和MDA的影響（，n=10）Table 4 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA（，n=10）

表4 趕黃草總黃酮對(duì)SOD和MDA的影響（，n=10）Table 4 Effects of the total flavonoids of Penthorum chinense Pursh on SOD and MDA（，n=10）

注：與正常組比較，aP ＜0.01；與模型組比較bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.5 趕黃草總黃酮對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響

2.5.1 大體肉眼觀察 A 組小鼠的肝臟肉眼觀察其形態(tài)及體積是正常的，外觀顏色呈現(xiàn)為紅褐色，質(zhì)地觸之有彈性、光滑且柔軟；而APAP損傷小鼠后，B組小鼠的肝臟重量及體積明顯增大，表面有顆粒感和腫脹感，并且有明顯的淤血；進(jìn)行了干預(yù)的C 組、D 組和E 組的肝臟受損情況有所改善，經(jīng)觀察接近正常組形態(tài)。

2.5.2 肝臟組織HE染色光鏡觀察 肝臟病理組織學(xué)檢查常用于判斷肝臟損傷，也是公認(rèn)的金指標(biāo)[23]。各組小鼠的肝組織病理變化光鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。A 組小鼠肝結(jié)構(gòu)清晰可辨且呈放射狀分布排列，具有完整性，排列規(guī)整，細(xì)胞的形態(tài)正常無(wú)異，體積大小正常，無(wú)壞死變性等出現(xiàn)；B組小鼠肝組織異常，肝小葉之間邊界不清晰，形態(tài)異常，結(jié)構(gòu)模糊，其排列極紊亂不整齊，肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)疏松，可見(jiàn)極其嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死，大量融合性出血性壞死（黑色箭頭），出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)小灶（黃色箭頭），殘留的肝細(xì)胞輕度腫脹；C組的肝小葉結(jié)構(gòu)比較清晰正常，損傷改善；D 組和E 組肝小葉結(jié)構(gòu)比較清晰可辨，損傷有改善，其中E組肝細(xì)胞有點(diǎn)狀壞死，肝小葉中有炎性壞死小灶（藍(lán)色箭頭）。

圖1 肝臟組織HE染色光鏡觀察結(jié)果（HE染色，×200）Figure 1 HE staining results of liver tissue under light microscopy（HE staining，×200）

3 討論

用APAP誘導(dǎo)和制備藥物性肝損傷模型，其優(yōu)點(diǎn)是易復(fù)制、操作簡(jiǎn)便、使用廣泛、成本低廉。一般情況下APAP作為家庭常用藥在治療劑量?jī)?nèi)使用是安全的[16]，但超安全劑量的使用或其他不正確的服用可導(dǎo)致急性藥物性肝損傷[24]。APAP 損傷肝臟的作用機(jī)制為APAP 在肝臟中進(jìn)行代謝的時(shí)候氧化產(chǎn)生少量反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會(huì)與還原型谷胱甘肽（GSH）相結(jié)合而耗盡肝細(xì)胞的GSH，從而導(dǎo)致多余的代謝產(chǎn)物不能被分解，此過(guò)程會(huì)破壞線粒體膜通透性及其功能，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化，增加TNF-α 的表達(dá)，激活炎性因子誘發(fā)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死[25-26]。

血清中ALT、AST、ALP、LDH屬于肝臟受到藥物性損傷的生物標(biāo)志指標(biāo)酶[27]，也是使用廣泛、操作簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)方式，這些指標(biāo)水平的高低反映了肝臟受到藥物損傷的程度[28]。本研究中，APAP 誘導(dǎo)的藥物性肝損傷模型組小鼠血清生物標(biāo)志指標(biāo)酶顯著升高，而D組、E組ALT、AST、ALP、LDH水平顯著降低，表明趕黃草總黃酮對(duì)APAP 引起的肝損傷起到了保護(hù)作用。

肝臟受到損傷時(shí)，活化的肝巨噬細(xì)胞將釋放TNFα、IL-6等促炎細(xì)胞因子，引發(fā)炎性反應(yīng)[29-30]，本研究中B組（模型組）小鼠肝組織的TNF-α、IL-6水平升高，而干預(yù)組TNF-α、IL-6 水平顯著降低，表明趕黃草總黃酮可能通過(guò)降低炎性因子的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)，從而對(duì)APAP引起的損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的膜完整性缺失，以致胞膜破裂和胞內(nèi)微粒體酶滲漏[31]。SOD作為人體最主要的內(nèi)源性抗氧化酶之一，能夠清除氧自由基，抵抗氧化應(yīng)激損傷[32]；MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的終產(chǎn)物，其水平升的越高則表明機(jī)體受損的情況越嚴(yán)重。本研究中，趕黃草總黃酮能有效升高SOD 的活性、降低MDA含量，表明趕黃草總黃酮可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)趕黃草總黃酮對(duì)APAP 所致肝損傷小鼠的肝臟系數(shù)增加、血清相關(guān)指標(biāo)水平以及肝組織炎性相關(guān)因子水平的升高均能有效降低，且能改善受損小鼠的肝臟病理狀態(tài)，有效提高SOD 活性，降低MDA含量。趕黃草總黃酮能起到保護(hù)APAP 所導(dǎo)致的急性藥物性肝損傷的作用，究其作用機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)和抗氧化作用相關(guān)。

（利益沖突：無(wú)）