姜黃素微乳凝膠的制備及體外抗炎抑菌研究

杜 麗，韓 笑，高旭輝，杜 艷(山西省腫瘤醫(yī)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院山西醫(yī)院，山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，太原 03003；山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；通訊作者，E-mail:dulinhui-004@63.com)

姜黃素(curcumin， CUR)是從姜科姜黃屬(CurcumaL.)植物姜黃的根莖中提取的一種化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化的功效[1]，但由于姜黃素極難溶于水，導(dǎo)致其口服吸收差，生物利用度低，限制其在臨床的應(yīng)用[2]。

微乳凝膠是將藥物與一定比例的油、乳化劑、助乳化劑和水制備得到微乳，然后加高分子載體材料制備成凝膠的制劑[3]，能夠改善藥物水溶性，提高其生物利用度。目前市售的藥品中，沒有CUR微乳及微乳凝膠的制劑。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，制備CUR微乳，并進(jìn)一步考察凝膠制備工藝，以改善CUR水溶性，提高藥物生物利用度，為制備CUR皮膚外用制劑進(jìn)行初步探索；并對(duì)所得制劑進(jìn)行小鼠耳腫脹抗炎研究、對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及大腸桿菌體外抑菌研究，為深入探討CUR微乳凝膠的抗炎抗菌效果提供理論依據(jù)。

1 儀器、試劑與動(dòng)物

UV-1200紫外分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；HC-2064型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；NDJ-5S數(shù)顯黏度計(jì)(上海衡平儀器儀表廠)。

CUR原料藥(批號(hào)：20160508，純度為99%，羅恩化學(xué)試劑有限公司)；卡波姆940(食品級(jí)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司)；肉桂油、曲拉通X-100(OP)(均為天津市登峰化學(xué)試劑廠)；色譜級(jí)甲醇、聚乙二醇400(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；丙三醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；三乙醇胺、甲醇分析純(天津市北辰方正試劑廠)；二甲苯(濟(jì)南大暉化工科技有限公司)；扶他林乳膏(北京諾華制藥有限公司)；尼泊金甲酯(山東萍聚生物科技有限公司)。

小鼠(昆明屬，SPF級(jí))，9只，來源于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXY(晉)2020-0001，雄性♂，體質(zhì)量(20±2)g，年齡為8周左右。本實(shí)驗(yàn)已通過山西省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)20210345)。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)與綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)均由山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 CUR微乳的制備

按照本課題組前期的研究，稱取肉桂油0.2 g，曲拉通X-100(OP)0.53 g，聚乙二醇(PEG)400 0.27 g，攪拌混合均勻，加CUR 25 mg，攪拌溶解，逐滴加蒸餾水4 g，不斷攪拌乳化得到CUR微乳。

2.2 CUR微乳凝膠的制備

先制備CUR微乳，加卡波姆-940適量，甘油適量，調(diào)pH至6.0。

2.2.1卡波姆-940用量考察分別考察卡波姆-940用量(質(zhì)量百分比g/g)為0.5%，0.8%，1.0%，1.2%，1.5%，2.0%，2.5%對(duì)CUR微乳凝膠外觀及黏度等指標(biāo)的影響[4]。使用數(shù)顯黏度計(jì)，按中國(guó)藥典2020版規(guī)定方法測(cè)定黏度。

結(jié)果表明，卡波姆-940用量為1.5%時(shí)，所得微乳凝膠的外觀澄清透明，制劑成型性良好，黏稠度適中，涂展性較好(見表1)。因此確定卡波姆-940用量為處方量的1.5%，即0.075 g。

表1 CUR微乳凝膠中卡波姆用量考察結(jié)果Table 1 Study on carbopol dosage in CUR microemulsion gel

2.2.2 甘油用量考察 其他處方條件不變，分別考察甘油占處方總質(zhì)量百分比(g/g)為0，3.0%，5.0%，8.0%，10.0%，12.0%時(shí)，CUR微乳凝膠外觀及黏稠度等指標(biāo)的變化[4]。結(jié)果表明，甘油用量為0～10.0%時(shí)，所得制劑外觀性狀、黏稠度、油膩感和涂展性差別不大，而黏度值有所差別，當(dāng)甘油用量為10.0%時(shí)，黏度為5 066 mPa·s，大小適中(見表2)，因此確定甘油用量為處方量的10%，即0.5 g。

表2 CUR微乳凝膠中甘油用量考察結(jié)果Table 2 Study on glycerol dosage in CUR microemulsion gel

2.3 pH值考察

其他處方條件不變，分別考察三乙醇胺調(diào)節(jié)pH為5.5，6.5，7.5，8.0時(shí)對(duì)CUR微乳凝膠外觀及黏稠度等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH為5.5時(shí)，制劑黏度值為5 066 mPa·s，大小適中，通過外觀評(píng)判，所得制劑外觀澄清透明，成型性良好，黏稠度適中，涂展性好(見表3)。因此，最終確定pH為5.5。

表3 CUR微乳凝膠中pH用量考察結(jié)果Table 3 Study on pH in CUR microemulsion gel

2.4 CUR微乳凝膠最佳處方確定

稱取肉桂油0.2 g，乳化劑OP 0.53 g，PEG400 0.27 g，攪拌混合均勻，加CUR25 mg，攪拌溶解，逐滴加蒸餾水4 g，不斷攪拌乳化制備微乳，加入卡波姆-940 0.075 g(1.5%)，甘油0.5 g(10%)，加三乙醇胺調(diào)節(jié)pH為5.5，最終制備得到CUR微乳凝膠。

2.5 CUR微乳凝膠的含量測(cè)定

分別取3批CUR微乳凝膠(20210430，20210501，20210502)各0.12 g，置于10 ml量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，混勻，取500 μl至10 ml容量瓶，定容至刻度。過微孔濾膜，進(jìn)液相20 μl，測(cè)定A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CUR微乳凝膠中的藥物質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，3批CUR微乳凝膠中含CUR分別為4.68，4.53，4.50 mg/g，含量均值±標(biāo)準(zhǔn)差為(4.57±0.01)mg/g，RSD為3.5%(n=3)。

2.6 CUR微乳凝膠的穩(wěn)定性考察

2.6.1 高速離心實(shí)驗(yàn) 取3批自制的CUR微乳凝膠(批號(hào):20210430，20210501，20210502)適量，分別置于離心管中，3 500 r/min離心15 min，結(jié)果3批CUR微乳凝膠，無油水分離等不穩(wěn)定現(xiàn)象，表明高速離心穩(wěn)定[5]。

2.6.2 耐寒實(shí)驗(yàn) 取3批CUR微乳凝膠適量，于-5 ℃冰箱中放置24 h，取出后恢復(fù)至室溫，然后觀察，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，CUR含量與耐寒實(shí)驗(yàn)前的含量無差異[(4.56±0.10)mg/gvs(4.57±0.01)mg/g，P>0.05]，表明制劑耐寒穩(wěn)定性良好[5]。

表4 制劑耐寒實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Cold resistance test results of the

2.6.3 耐熱實(shí)驗(yàn) 取3批CUR微乳凝膠適量，于45 ℃水浴鍋中放置24 h，取出后冷卻至室溫。結(jié)果表明，各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)前無明顯差異(見表5)。采用配對(duì)t檢驗(yàn)，CUR含量與耐熱實(shí)驗(yàn)前的含量相比，有所下降[(4.08±0.07)mg/gvs(4.57±0.01)mg/g，P<0.05]，表明CUR微乳凝膠不耐熱，應(yīng)置于陰涼處貯存。

表5 制劑耐熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Hot resistance test results of the

2.7 CUR微乳凝膠的抗炎功效評(píng)價(jià)

2.7.1 二甲苯所致小鼠耳腫脹研究 按照文獻(xiàn)[5]所述方法，取昆明種小鼠9只，從籠中隨機(jī)選取小鼠分為3組，每組3只：生理鹽水組、扶他林乳膏組、CUR微乳凝膠組。生理鹽水組每只小鼠給生理鹽水0.2 ml，扶他林乳膏組和CUR微乳凝膠組每只小鼠給藥0.2 g，小鼠連續(xù)給藥3 d，每天給藥2次，于末次給藥1 h后小鼠右耳廓內(nèi)外側(cè)均勻涂抹二甲苯30 μl，左耳為自身對(duì)照，致炎30 min后頸椎脫臼處死小鼠，剪下耳朵，用打孔器(直徑6 mm)于雙耳對(duì)稱部位取下圓耳片，稱重，計(jì)算小鼠耳廓腫脹抑制率(%)。小鼠耳廓腫脹抑制率(%)=[(C0-Ct)/C0]×100%，C0為陰性對(duì)照組平均耳廓腫脹度；Ct為給藥組平均耳廓腫脹度。

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行方差分析比較三組之間是否有差異，然后采用Dunnett’st檢驗(yàn)比較兩組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由表6可知，與生理鹽水組相比，CUR微乳凝膠組二甲苯致小鼠耳腫脹度能顯著降低(P<0.05)，對(duì)小鼠耳腫脹抑制率為55.27%，表明CUR微乳凝膠具有抗炎作用。

表6 CUR微乳凝膠對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響Table 6 Effect of CUR microemulsion gel on auricle swelling induced by xylene in

2.7.2 CUR微乳凝膠的抑菌效果評(píng)價(jià) 參考資料[5]所述方法，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，空白微乳凝膠基質(zhì)組作為陰性對(duì)照、0.4%尼泊金甲酯組作為陽(yáng)性對(duì)照、CUR微乳凝膠組作為供試品。取瓊脂適量，溶解于超純水，攪拌均勻，加熱至沸騰，121 ℃高溫高壓滅菌30 min，溫度降低后分裝于滅菌的培養(yǎng)皿備用。抑菌圈實(shí)驗(yàn)采用孔洞法，精密吸取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與綠膿桿菌供試菌菌懸液300 μl于無菌培養(yǎng)皿，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，混合均勻菌液與培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后，等距離打孔，標(biāo)記，分別精密吸取80 μl的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照與供試品于孔中，輕輕混勻，待凝固后倒扣平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑大小，每種菌平行3組實(shí)驗(yàn)，取平均值，采用SPSS12.0軟件，進(jìn)行方差分析比較三組之間是否有差異，然后采用Dunnett’st檢驗(yàn)比較兩組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>20 mm，極敏；15～20 mm，高敏；10～15 mm，中敏；<7 mm，不敏感。

結(jié)果顯示，與空白微乳凝膠基質(zhì)組比較，CUR微乳凝膠組對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與綠膿桿菌均有顯著的抑制作用(P<0.05，見表7)。結(jié)果表明，CUR微乳凝膠具有一定的體外抑菌作用。

表7 CUR微乳凝膠的抑菌結(jié)果Table 7 Bacteriostatic results of CUR microemulsion

3 討論

3.1 微乳凝膠的制備實(shí)驗(yàn)

目前資料報(bào)道的CUR微乳凝膠處方為：CUR7.2 mg，辛葵酸甘油酯3 g，乳化劑OP2.3 g，PEG400 4.7 g，卡波姆-934 0.5 g，三乙醇胺適量，加水至36 g[2]。該文獻(xiàn)處方中CUR只有7.2 mg，而本研究的制劑處方中CUR為25 mg，含藥量遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道，本研究進(jìn)一步優(yōu)化了制劑處方，提高了制劑含藥量。

在制備CUR微乳凝膠過程中，文獻(xiàn)采用的方法為：先將卡波姆-934與甘油、水混合，加三乙醇胺調(diào)節(jié)pH，成凝膠后再與CUR微乳混合，所得制劑含水量較高，制劑黏稠度小[2]。本研究考慮微乳中和凝膠劑中均含有水分，會(huì)降低制劑黏稠度。為了使制劑黏稠度適中，本研究在CUR微乳中直接加卡波姆-940、甘油，加三乙醇胺調(diào)節(jié)pH制備成CUR微乳凝膠。所得產(chǎn)品性能優(yōu)良，外觀澄清透明，涂展性好，黏稠度適中。方法步驟較文獻(xiàn)簡(jiǎn)化，所得產(chǎn)品性能優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。

3.2 抗炎抑菌實(shí)驗(yàn)

CUR具有抗炎抑菌的效果，但由于其水中溶解度差的問題，影響其應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將CUR制備成微乳凝膠后，適合在皮膚局部進(jìn)行使用。該制劑淡黃色，均勻細(xì)膩，具備微乳和凝膠的雙重特性，增加了CUR的溶解度，方便于局部皮膚釋放藥物，生物相容性和穩(wěn)定性良好。而且經(jīng)過小鼠二甲苯耳腫脹實(shí)驗(yàn)和抑菌實(shí)驗(yàn)的研究表明，CUR微乳凝膠具有一定的抗炎抑菌效果，為其制劑的開發(fā)研究奠定理論基礎(chǔ)。