miR-21-5p通過調(diào)控TGF-β1減輕2型糖尿病心肌病小鼠的心肌損傷

秦超師，陳蕊蕊，李澤霖，紀兆樂，劉鵬云(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710038；通訊作者，E-mail:pengyltdyy@126.com)

糖尿病及其并發(fā)癥已成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。糖尿病患者死亡的主要原因是心血管疾病。既往研究也顯示，即使血糖水平處于糖尿病前期的人群，其發(fā)生遠期心血管事件和全因死亡的風(fēng)險也顯著增加[1，2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，是糖尿病患者因代謝紊亂引起的非缺血性、非高血壓性心肌病，其特點是心臟結(jié)構(gòu)改變和左室功能障礙[3，4]。糖尿病心肌病的進展通過炎癥、氧化應(yīng)激和糖脂毒性等引起，從而導(dǎo)致糖尿病心臟的結(jié)構(gòu)改變[5]。DCM已經(jīng)被認為是糖尿病患者心力衰竭高發(fā)病率和高死亡率的主要因素。

microRNAs(miRNAs)是一類長度約為20～24個核苷酸的非編碼單鏈內(nèi)源性小RNA，在動植物中調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達。miRNAs已被發(fā)現(xiàn)參與細胞分化、發(fā)育、組織生長和脂肪代謝等生理過程[6]。最近的研究表明，它們可以作為各種心血管疾病的潛在調(diào)節(jié)劑[7]。其中microRNA-21-5p(miR-21-5p)廣泛存在于哺乳動物組織和器官中，Qiao等[8]報道m(xù)iR-21-5p可以通過調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號通路來增強血管生成和心肌細胞存活，從而促進心臟修復(fù)。并且本課題組前期研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p可顯著改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[9]。然而，miR-21-5p對2型糖尿病條件下的心肌細胞損傷的影響及作用機制有待進一步探究。

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)是一種多功能細胞因子，可調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡[10]。人體內(nèi)有3種TGF-β亞型，它們具有相似的生物學(xué)特征。其中，TGF-β1的存在比例最大，活性最高。它可通過自分泌和旁分泌途徑發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，參與到炎癥激活及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生過程中[11]。本研究擬通過對db/db小鼠心肌miR-21-5p的表達進行增強和抑制處理，研究miR-21-5p對DCM小鼠心肌氧化應(yīng)激、炎癥和細胞凋亡的影響及miR-21-5p能否靶向TGF-β1發(fā)揮作用，以期為DCM所致的心肌損傷提供新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性db/db和db/m小鼠，8周齡，購自南京大學(xué)模式動物研究所。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-001，動物使用許可證號：SYXK(陜)2020-007。所有小鼠均在清潔級動物實驗室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗通過空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理審查委員會的審批(審批號:DW-KYD2021-065)。

1.1.2 主要試劑 乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB， CK-MB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)購自美國Invitrogen公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；TUNEL檢測試劑盒購自美國Roche公司；TRIzol試劑購自美國Merck公司；miR-21-5p、TGF-β1、NOX2、NOX4、U6和GAPDH的引物由上海生工生物科技有限公司構(gòu)建；逆轉(zhuǎn)錄PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒和PrimeScriptTM PLUS RT-PCR Kit試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；miRNA NC、miR-21-5p agomir和miR-21-5p antagomir購自上海吉瑪公司，miRNA NC序列為5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′，miR-21-5p agomir序列為5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miR-21-5p antagomir序列為：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′；TGF-β1、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain， ASC)、cleaved Caspase-1、cleaved Caspase-3及GAPDH抗體購自美國Abcam公司；羊抗兔、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 為了探究agomir和antagomir對心肌miR-21-5p表達水平的影響，將24只db/m小鼠隨機分為正常對照組(Con組)、miRNA NC處理組(miR-NC組)、miR-21-5p agomir處理組(miR-agomir組)和miR-21-5p antagomir處理組(miR-antagomir組)，每組6只。miR-NC、miR-agomir組和miR-antagomir組小鼠每3 d分別經(jīng)尾靜脈注射100 μl 10 nmol/L的miRNA NC、miR-21-5p agomir和miR-21-5p antagomir，共10次。Con組小鼠則在相同時間點經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。完成末次尾靜脈注射后1 d，處死小鼠并取材，采用qRT-PCR法測定各組小鼠心臟miR-21-5p mRNA表達水平。

為了探究miR-21-5p對2型糖尿病心肌病小鼠心肌損傷的影響及機制，將30只db/db小鼠隨機分為模型組(DCM組)、模型+miR-21-5p agomir處理組(DCM+miR-agomir組)和模型+miR-21-5p antagomir處理組(DCM+miR-antagomir組)，每組10只。另選取10只db/m小鼠作為正常對照組(Con組)。DCM+miR-agomir組和DCM+miR-antagomir組小鼠每3 d分別經(jīng)尾靜脈注射10 nmol/L的miR-21-5p agomir和miR-21-5p antagomir，共10次。Con組和DCM組小鼠則在相同時間點經(jīng)尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。db/db小鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，db/m小鼠則繼續(xù)給予正常飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 生化指標測定 ①LDH及CK-MB水平測定：采用眼眶取血法取血約1 ml，靜置后留取上層血清。按照說明書使用試劑盒檢測血清中CK-MB和LDH水平。②MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平測定：將心臟組織置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗后，按質(zhì)量體積比為1 ∶10的比例用勻漿機勻漿。離心取上清，按照相應(yīng)試劑盒說明書檢測心肌組織中MDA、SOD、GSH和GSH-Px的水平。③TNF-α、IL-1β和IL-6水平測定：按照提供的ELISA試劑盒說明書檢測小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。用酶標儀測量相應(yīng)波長下的光密度(OD)值。繪制OD值與濃度的標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.2.3 超聲心動圖檢測 小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.05 ml/20 g)麻醉后固定四肢，脫去小鼠心前區(qū)毛發(fā)，使用超聲探頭進行檢測。采用二維超聲心動圖檢測左心室短軸部分，M型超聲心動圖檢測左心室運動情況。所有數(shù)據(jù)在相同參數(shù)下處理，每個測量指標值為連續(xù)3個心動周期的平均值。通過計算得出左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，以評價左室心臟收縮功能。

1.2.4 心肌細胞凋亡檢測 將心臟石蠟切片進行常規(guī)脫蠟、水合處理，磷酸鹽平衡液(PBS)洗滌3次。玻片在20%正常胎牛血清中室溫孵育30 min，將TUNEL反應(yīng)混合物滴在切片上，37 ℃孵育1 h。PBS液洗滌3次后經(jīng)3% H2O2甲醇溶液室溫封閉10 min。最后用DAPI染液復(fù)染細胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察，凋亡細胞核顯示為綠色。

1.2.5 qRT-PCR測定miR-21-5p、TGF-β1、NOX2、NOX4 mRNA表達水平 使用TRIzol試劑從組織和細胞中分離總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄并進行cDNA擴增。反應(yīng)參數(shù):95 ℃變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。引物序列見表1。miR-21-5p的表達量以U6為參照，TGF-β1、NOX2和NOX4的表達量以GAPDH為參照，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR分析引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR analysis

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 為了驗證TGF-β1是否是miR-21-5p的有效靶點，我們將構(gòu)建的野生型TGF-β1 WT 3′-非翻譯區(qū)(untranslational region， UTR)和突變型TGF-β1 MuT 3′-UTR插入檢測質(zhì)粒中。H9c2細胞與含有TGF-β1 3′-UTR的質(zhì)粒和miR-21過表達質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染，以非靶向陰性對照RNA共轉(zhuǎn)染作為對照。轉(zhuǎn)染后48 h，利用雙熒光素酶試劑盒檢測細胞熒光強度，以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值表示熒光素酶相對活性。

1.2.7 心肌組織ROS生成檢測 迅速摘下心臟標本用冷凍切片機切成5 μm的切片，放置在冷凍的顯微鏡載玻片上。將二氫乙錠(DHE)染液滴加在玻片上，37 ℃的水浴箱中孵育30 min。PBS溶液洗片后用激光共聚焦顯微鏡觀察，采用Image J軟件對DHE熒光強度進行分析以表示ROS生成量的多少。

1.2.8 心肌組織蛋白表達測定 用裂解緩沖液提取心肌組織總蛋白，樣品檢測濃度后，按50 μg每孔的蛋白上樣量用6%～15% SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉膜2 h，然后膜與TGF-β1(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、ASC(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-1(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)及GAPDH(1 ∶5 000)一抗抗體在4 ℃的溫度下過夜孵育。次日，用含Tris 0.1% Tween 20緩沖液洗滌膜3次，與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1 h，采用增強化學(xué)發(fā)光法和生物特征凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白水平，并以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)間差異采用Student’st檢驗，單因素方差分析(ANOVA)加Tukey’s post hoc檢驗用于分析比較多組數(shù)據(jù)間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p agomir和antagomir對miR-21-5p表達水平的影響

為了檢驗miR-21-5p agomir和miR-21-5p antagomir對小鼠心肌miR-21-5p表達改變的有效性，通過qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，miR-agomir組小鼠心肌miR-21-5p表達顯著提高(P<0.01)，而miR-antagomir組小鼠心肌miR-21-5p表達明顯被抑制(P<0.01)，并且miR-NC組與Con組小鼠心肌miR-21-5p表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖1)。以上結(jié)果表明尾靜脈注射miR-21-5p agomir和miR-21-5p antagomir能有效改變小鼠心肌miR-21-5p表達，而miRNA NC對小鼠心肌miR-21-5p表達無明顯影響。

與Con組相比，**P<0.01圖1 miR-21-5p agomir和antagomir對miR-21-5p表達水平的影響Figure 1 Effects of miR-21-5p agomir and antagomir on the expression level of miR-21-5p

2.2 各組小鼠心肌組織中miR-21-5p和TGF-β1表達水平比較

與Con組相比，DCM組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達顯著下降(P<0.01)，TGF-β1表達明顯升高(P<0.01，見圖2)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達進一步減低(P<0.05)，TGF-β1表達進一步增加(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達則顯著提高(P<0.01)，TGF-β1表達明顯降低(P<0.01，見圖2)。

與Con組相比，**P<0.01；與DCM組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 各組小鼠心肌組織中miR-21-5p和TGF-β1表達水平比較Figure 2 Comparison of expression of miR-21-5p and TGF-β1 in myocardial tissue among four groups

2.3 各組小鼠心功能及心肌損傷標志物表達水平比較

通過檢測血清心肌損傷標志物L(fēng)DH及CK-MB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DCM組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB水平顯著上升(P<0.01)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平進一步增加(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平顯著降低(P<0.01，見圖3)。超聲心動圖檢測心臟功能結(jié)果顯示，與Con組相比，DCM組小鼠LVEF和LVFS值顯著下降(P<0.01)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠LVEF和LVFS值進一步減低(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠LVEF和LVFS值明顯提高(P<0.01，見圖3)。

與Con組相比，**P<0.01；與DCM組相比，##P<0.01圖3 各組小鼠心功能及心肌損傷標志物表達比較Figure 3 Comparison of cardiac function and myocardial injury markers among four groups

2.4 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較

TUNEL染色結(jié)果顯示，與Con組相比，DCM組小鼠凋亡心肌細胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)，且誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡的剪切蛋白cleaved Caspase-3表達顯著上升(P<0.01)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠心肌細胞凋亡數(shù)目進一步增加(P<0.01)，cleaved Caspase-3表達進一步上升(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠心肌細胞凋亡數(shù)目明顯減少(P<0.01)，且cleaved Caspase-3表達顯著下降(P<0.01，見圖4)。

與Con組相比，*P<0.05，**P<0.01；與DCM組相比，##P<0.01圖4 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較Figure 4 Comparison of cardiomyocyte apoptosis among four groups

2.5 各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平比較

與Con組相比，DCM組小鼠心肌組織MDA含量及ROS生成量顯著增加(P<0.01)，NOX2和NOX4 mRNA表達顯著上升(P<0.01)，而SOD、GSH和GSH-Px的含量則明顯下降(P<0.01，見圖5和圖6)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠心肌組織MDA含量及ROS生成量進一步增加(P<0.01)，NOX2和NOX4 mRNA表達進一步上升(P<0.01)，而SOD、GSH和GSH-Px的含量則進一步下降(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠心肌組織MDA及ROS的生成顯著降低(P<0.01)，NOX2和NOX4 mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.01)，同時SOD、GSH和GSH-Px的合成明顯增加(P<0.01，見圖5和圖6)。

與Con組相比，**P<0.01；與DCM組相比，#P<0.05，##P<0.01圖5 各組小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平比較Figure 5 Comparison of levels of MDA， SOD， GSH and GSH-Px in myocardial tissues among four groups

與Con組相比，**P<0.01；與DCM組相比，##P<0.01圖6 各組小鼠心肌組織ROS生成及氧化應(yīng)激相關(guān)分子表達比較(紅色熒光顯示切片ROS著色)Figure 6 Comparison of ROS generation and expressions of oxidative stress-related molecules in myocardial tissues among four groups

2.6 各組小鼠心肌組織炎癥水平比較

與Con組相比，DCM組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著增加(P<0.01)，NLRP3、ASC和cleaved Caspase-1表達明顯上升(P<0.01)。與DCM組相比，DCM+miR-antagomir組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平進一步增加(P<0.01)，NLRP3、ASC和cleaved Caspase-1表達進一步上升(P<0.01)；而與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，NLRP3、ASC和cleaved Caspase-1表達顯著下調(diào)(P<0.01，見圖7)。

與Con組相比，**P<0.01；與DCM組相比，##P<0.01圖7 各組小鼠心肌組織炎癥水平比較Figure 7 Comparison of inflammation levels in myocardial tissues among four groups

2.7 miR-21-5p靶向調(diào)控TGF-β1的表達

為了進一步明確miR-21-5p和TGF-β1分子間的靶向調(diào)控關(guān)系，我們通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，TGF-β1是miR-21-5p的潛在靶基因(見圖8)。雙熒光素酶實驗報告發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21-5p顯著抑制野生型TGF-β1的表達水平(P<0.01)，而突變型組中過表達miR-21-5p對TGF-β1的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖8)，提示TGF-β1是miR-21-5p的靶基因。并且，與TGF-β1組相比，TGF-β1+miR-21-5p mimic組H9c2細胞中TGF-β1蛋白和mRNA水平均顯著降低(P<0.01，見圖9)，進一步驗證了TGF-β1是miR-21-5p的下游靶基因。

與NC組相比，**P<0.01圖8 雙熒光素酶實驗報告miR-21-5p和TGF-β1分子間的靶向關(guān)系Figure 8 Targeted relationship between miR-21-5p and TGF-β1 by dual luciferase experiment

與TGF-β1組相比，**P<0.01圖9 miR-21-5p靶向調(diào)控TGF-β1的表達Figure 9 MiR-21-5p targets the expression of TGF-β1

3 討論

糖尿病是最常見的慢性疾病之一，給全世界的公共衛(wèi)生帶來了巨大的負擔?，F(xiàn)全球有4.51億糖尿病患者，預(yù)計到2045年這一數(shù)字將上升到6.93億[12]。

心血管并發(fā)癥是與糖尿病相關(guān)的主要死亡原因，占死亡人數(shù)的50%～80%[2]。糖尿病心肌病是糖尿病患者因代謝紊亂引起的非缺血性、非高血壓性心肌病，患病率約占糖尿病人群的17%[3]。與非糖尿病患者相比，2型糖尿病患者因糖尿病心肌病導(dǎo)致的心力衰竭、心律失常和猝死的發(fā)生率明顯增加[13]。因此，有必要尋找有效的干預(yù)措施，以減輕糖尿病患者發(fā)生的心肌損傷。

相關(guān)研究已經(jīng)證實，miR-21在心血管疾病的診斷和治療中發(fā)揮了重要作用[14，15]。前期本課題組研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p可顯著改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[9]。更為重要的是，與非糖尿病對照相比，miR-21-5p及其外泌體在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心臟中的表達水平均顯著降低[16]。同時，Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，激活GAS5/miR-21-5p軸可以減輕高糖誘導(dǎo)的人心肌樣AC16細胞損傷。Han等[18]報道證實，miR-21-5p通過PTEN/Akt/FOXO3a信號通路減輕高糖/高脂引起的H9c2細胞損傷。然而，miR-21-5p是否同樣能在在體動物水平上發(fā)揮改善糖尿病心肌損傷的作用及其潛在的分子機制仍需進一步探究。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，DCM組小鼠心肌組織miR-21-5p的表達顯著下降。而miR-21-5p激動劑和拮抗劑的應(yīng)用表明，與DCM組相比，上調(diào)miR-21-5p的表達可顯著降低糖尿病心肌病小鼠血清內(nèi)LDH及CK-MB的水平，明顯提高心臟功能(LVEF和LVFS值顯著上升)，顯著抑制心肌細胞凋亡及cleaved Caspase-3表達。以上結(jié)果提示，上調(diào)心肌miR-21-5p同樣可以顯著減輕糖尿病心肌損傷。

雖然DCM的確切病理生理機制尚未完全闡明，但線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、心肌細胞凋亡或壞死、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、心肌纖維化、糖脂毒性等均參與其中[19]。在這些機制中，氧化應(yīng)激和炎癥對糖尿病心肌代謝障礙起著重要作用。氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)心肌細胞代謝穩(wěn)態(tài)的失衡，導(dǎo)致葡萄糖耐受不良。反之這些用于產(chǎn)生能量的底物的改變導(dǎo)致脂肪酸攝取和氧化失衡，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙并產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)?；钚匝鹾脱趸瘧?yīng)激則可通過蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷等途徑誘導(dǎo)細胞功能障礙和細胞損傷[20]。此外，2型糖尿病患者中慢性心肌炎癥介導(dǎo)的心肌代謝改變會導(dǎo)致心肌細胞凋亡和鈣處理受損，而介導(dǎo)的心臟結(jié)構(gòu)變化則可繼發(fā)心肌細胞肥大和心肌纖維化[21]。因此，有效抑制心肌氧化應(yīng)激和炎癥是改善糖尿病心肌病心肌損傷及延緩糖尿病心肌病向晚期心衰發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵措施。

大量研究報道，miR-21-5p具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗炎特性。Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中，miR-21-5p表達的增強可改善腎功能和腎組織病理損傷，減輕血清炎癥反應(yīng)，降低腎組織的凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)。Shen等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EXOs通過miR-21-5p促進巨噬細胞極化為M2表型，從而減少炎癥并促進心臟修復(fù)。Yuan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21-5p通過抑制自噬繼而減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RSC96細胞凋亡。我們的實驗結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，與DCM組相比，上調(diào)miR-21-5p的表達可明顯減低糖尿病小鼠心肌組織MDA及ROS的生成，顯著下調(diào)NOX2和NOX4 mRNA的表達，同時明顯增加SOD、GSH和GSH-Px的水平。此外，與DCM組相比，DCM+miR-agomir組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，NLRP3、ASC和cleaved Caspase-1表達明顯下降。以上結(jié)果表明，miR-21-5p可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)緩解糖尿病心肌病小鼠的心肌損傷。

為了進一步闡明miR-21-5p減輕心肌組織氧化應(yīng)激和炎癥的潛在分子機制，我們通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，TGF-β1不僅在調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥中發(fā)揮了重要作用[25]，也在調(diào)控糖尿病心肌病心肌損傷中扮演關(guān)鍵角色[10]。Wu等[26]報道表明，替米沙坦通過TGF-β1/Smad信號通路減輕糖尿病心肌病大鼠炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡。Dugbartey等[27]報道證實，硫辛酸、格列齊特和雷米普利聯(lián)合治療可通過抑制TGF-β1/Smad通路預(yù)防糖尿病性心肌病的發(fā)生。更為重要的是，miR-21-5p與TGF-β1在相關(guān)研究中已證實具有潛在的調(diào)控關(guān)系。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21可直接抑制TGF-β1介導(dǎo)的糖尿病腎病纖維化。雷磊等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p通過靶向抑制TGF-β1的表達來減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥。史東東等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p通過靶向下調(diào)TGF-β1的表達水平，促進大鼠H9c2心肌細胞增殖和抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1在DCM組中異常高表達，經(jīng)miR-21-5p agomir處理后，TGF-β1蛋白表達水平顯著降低。雙熒光素酶結(jié)果顯示，miR-21-5p與TGF-β1相互作用，在DCM小鼠心肌組織中miR-21-5p能靶向負調(diào)控TGF-β1。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p通過靶向負調(diào)控TGF-β1的表達抑制心肌組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，減輕了細胞凋亡和心臟功能障礙，從而緩解了糖尿病心肌病小鼠的心肌損傷。miR-21-5p有望成為臨床上糖尿病患者發(fā)生心肌損傷時的關(guān)鍵分子干預(yù)靶點。